金魚PP2A-B″家族調(diào)節(jié)基因的cDNA克隆及mRNA表達分析.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是真核生物體內(nèi)基本的調(diào)控機制。蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在調(diào)控細胞內(nèi)各種生命過程中起了重要的作用。PP2A是主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一，而其眾多的調(diào)節(jié)亞基在PP2A發(fā)揮功能時起著重要的作用。 本論文中，以金魚卵巢組織作為實驗材料，運用RT—PCR技術(shù)和cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)克隆得到蛋白磷酸酶2A（PP2A）調(diào)節(jié)亞基B"家族中alpha（PR130）基因cDNA部分序列和beta（PR67

2、）基因、gamma（G5PR）基因cDNA全序列。結(jié)果顯示α基因cDNA長1781bp，編碼的多肽共含有426個氨基酸，系α亞基的部分蛋白序列，β基因cDNA長2561bp，編碼的蛋白質(zhì)共含有581個氨基酸，而γ基因cDNA全長1885bp，編碼一個含有457個氨基酸的蛋白質(zhì)。比較分析發(fā)現(xiàn)，三個調(diào)節(jié)亞基與已知其他物種對應的B"家族調(diào)節(jié)亞基均有著很高的同源性，分別達到68.3％、52.9％和83.6％，說明三個調(diào)節(jié)基因在物種間的進化上比較

3、保守。PP2A—B"家族成員間的氨基酸序列比對結(jié)果顯示，與PP2A—B"調(diào)節(jié)基因γ相比，PP2A—B"調(diào)節(jié)基因α與β間具有更高的相似性，暗示α與β兩調(diào)節(jié)基因在行駛功能時具有一定的相關(guān)性，而γ的作用方式與α和β有較大差異。 結(jié)構(gòu)預測分析顯示，α、β、γ三條多肽均存在PP2A調(diào)節(jié)亞基B"家族成員共有的兩個EF—HAND基序，位于調(diào)節(jié)亞基的C端。將三個亞基與三聚體PP2A/B'γ1裝配模型中的調(diào)節(jié)亞基B'γ1作氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)在P

4、P2A全酶裝配中起重要作用的B'γ1HEAT—like重復結(jié)構(gòu)中的特定殘基在B"家族調(diào)節(jié)亞基中并不保守，提示B"家族調(diào)節(jié)亞基中的EF—HAND基序可能與B'γ1中的HEAT—like重復結(jié)構(gòu)存在功能上的相似性，在三聚體PP2A的裝配中起重要作用。另外，EF—HAND基序也可能作為Ca2+調(diào)控的調(diào)節(jié)元件參與對PP2A—B"家族蛋白功能的調(diào)節(jié)。 用RT—PCR半定量的方法檢測了PP2A—B"α、β、γ三個調(diào)節(jié)基因在金魚不同組織和胚胎

5、發(fā)育不同時期的mRNA表達水平。結(jié)果表明，α、β兩亞基的表達呈現(xiàn)明顯的組織和胚胎發(fā)育階段差異性，α亞基在卵巢和肌肉組織中最高，在腎臟和鰓中最底，在原腸胚、神經(jīng)胚、腦泡分化和體色素等胚胎發(fā)育時期的表達較弱，而在其他時期中的表達較強；β亞基的表達結(jié)果與α亞基相似，在卵巢中最強，在精巢中次之，也同樣在腮中的表達量最低，不僅如此，β亞基與α亞基在金魚胚胎表達方面更加相似；與α、β兩亞基表達模式相比，γ亞基在金魚多種組織和各個胚胎發(fā)育時期中均有較