金魚PP2A-B〃家庭調(diào)節(jié)亞基β基因在胚胎發(fā)育中的功能研究.pdf

1、在細胞的生命活動中,蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化有著非常重要的意義。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A,PP2A)作為蛋白磷酸酶家族中十分重要的一員,它與絕大部分真核細胞的各種調(diào)控都有非常密切的關(guān)系.PP2A作為主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一,其調(diào)節(jié)亞基對PP2A行使功能具有巨大的作用。為了研究PP2A在低等脊椎動物中的功能,運用RT-PCR和末端快速擴增法,從金魚中克隆到了PP2A調(diào)節(jié)亞基”中β基因的cDNA全長序

2、列。結(jié)果顯示,從金魚中克隆得到的β基因包括一個含1746個核苷酸的開放閱讀框和編碼一個67KD的蛋白。
　　 試驗中利用反義核酸技術(shù)研究PR72/B”/β的功能。反義核酸就是指能夠與特定的mRNA準確互補、特異性的阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。通過使用反義核酸特異性的使某些基因的表達被降低或停止,此過程即為反義核酸技術(shù)。其包括三種技術(shù),分別是:反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)。在行使基因下向調(diào)節(jié)作用因子的功能

3、時,反義核酶對降低一些有害基因的表達和失去控制的基因的過度表達起著非常重要的作用。與傳統(tǒng)的基因干擾手段相比,反義核酸具有更多的優(yōu)點。①高度特異性:反義核酸作用于靶RNA或DNA的原理相似于“生物導彈”,通過特異的堿基互補配對作用。②高生物活性和豐富的信息量:作為一種含有特定遺傳信息的信息體,反義核酸的堿基排列有著無窮的變化。③高效性:有效并且直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。④低毒、安全:目前的研究并沒有發(fā)現(xiàn)反義核酸的明顯毒性,雖然其在

4、體內(nèi)的停留時間有長有短,但最終都會被降解。反義核酸抑制基因表達時具有廣譜性,不僅可以用來抑制酶和受體蛋白,還可以用來傳統(tǒng)方法難以起效的接頭蛋白(adaptor)、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。
　　 在了解PR72/B”/β在金魚胚胎發(fā)育中的具體功能中,利用已經(jīng)克隆到的金魚PR72/B”/β cDNA序列,運用相關(guān)的技術(shù)構(gòu)建相應的pEGFP反義表達載體,通過顯微注射的方法將載體注射到金魚的受精卵中,以觀察其對胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,當

5、下調(diào)PR72/B”/β基因的表達時,在金魚的胚胎時期發(fā)現(xiàn)了明顯的組織和器官的畸形表型。在出膜期大約有81％的綠色熒光胚胎出現(xiàn)畸形,在顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)在脊椎和尾巴的發(fā)育不全或缺失。這些結(jié)果表明,PP2A調(diào)節(jié)亞基對組織和器官的生成有著非常重要的作用,PR72/B”/β基因?qū)τ诮痿~胚胎發(fā)育是不可缺少的。在下序的工作中對畸形的胚胎進行了石蠟切片。從切片的結(jié)果可以看出,有超過79％的畸形胚胎的眼睛有明顯的畸形,其中,眼睛晶狀體出現(xiàn)更多