牙鲆堿性磷酸酶全基因的克隆、序列分析及5’調(diào)控區(qū)功能分析.pdf

1、堿性磷酸酶(ALP)是一種單脂磷酸水解酶，它本身是一種膜結(jié)合金屬糖蛋白。ALP由一個(gè)多基因家族編碼，目前人和小鼠的ALP基因均已被克隆。根據(jù)基因限位，人和小鼠都有一種組織非特異性ALP(Tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TSNALP)，在肝、腎、骨骼、早期胚胎等組織中表達(dá)。另外，人和小鼠還分別有3種和2種組織特異性ALP(tissue-specific alkaline phosphatas

2、e，TSALP)，包括人的腸ALP、胎盤ALP和生殖細(xì)胞ALP；小鼠的腸ALP和胚胎ALP。 目前在哺乳動(dòng)物中關(guān)于ALP基因的克隆、生理功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已有很多報(bào)道，但水生動(dòng)物ALP基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。近幾年本實(shí)驗(yàn)室圍繞著ALP在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的作用，開展了一系列工作，研究表明ALP活性的變化明顯影響變態(tài)時(shí)期牙鲆仔魚的骨骼細(xì)胞的形態(tài)及消化功能。本實(shí)驗(yàn)室通過RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA序列，而且通

3、過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)水平甲狀腺激素可以上調(diào)ALP的表達(dá)。為了確定牙鲆ALP基因的類型、分析基因結(jié)構(gòu)特征，本研究首次在魚類中分離出ALP全基因序列。牙鲆堿性磷酸酶基因全長(zhǎng)10kb，含有11個(gè)外顯子、10個(gè)內(nèi)含子。11個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別是69bp、117bp、117bp、174bp、174bp、141bp、69bp、135bp、192bp、84bp、410bp。10個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別是1587bp、170bp、356bp、1857

4、bp、91bp、331bp、791bp、1188bp、1209bp、791bp，A／T含量分別是62％、51％、66％、60.04％、51.6％、59.5％、61.6％、59.3％、55.1％、56％，符合內(nèi)含子A／T含量高的特點(diǎn)。外顯子和內(nèi)含子的連接符合GT-AG的剪切原則(除了外顯子10)。起始密碼子ATG位于第一個(gè)外顯子，ALP活性位點(diǎn)序列位于第4個(gè)外顯子。在線軟件預(yù)測(cè)第一個(gè)內(nèi)含子中兩個(gè)位點(diǎn)可能具有啟動(dòng)子活性，同時(shí)存在Ccaat／

5、Enhancer Box、RXR、CAAT、CREB、Octamer、GATA、ERE、SREBPs、APl、鋅指蛋白等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。此外，在第三個(gè)、第九個(gè)內(nèi)含子中存在(CA)23、(TG)55、(TG)12重復(fù)的微衛(wèi)星序列，目前，這些微衛(wèi)星序列在Genbank中還沒有登錄，可能是新的微衛(wèi)星標(biāo)記。根據(jù)牙鲆ALP全基因的結(jié)構(gòu)特征以及mRNA的組織分布特點(diǎn)，認(rèn)為克隆的牙鲆ALP屬于組織非特異性ALP。 利用生物信息學(xué)對(duì)克隆得到的

6、牙鲆ALP基因5'調(diào)控區(qū)進(jìn)行分析，牙鲆ALP基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)位于翻譯起始密碼子(ATG)上游65bp處，牙鲆ALP基因5'調(diào)控區(qū)沒有典型的TATA、CAAT、GC盒，推測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-42～-35處TATTAAAA可能是TATA盒，在線軟件分析表明5'調(diào)控區(qū)內(nèi)可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP

7、4等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)軟件預(yù)測(cè)在牙鲆ALP基因5'調(diào)控區(qū)-105～-81處TTTTCAGTCACTGGTCATAAATTTG與共有序列AGGTCA很相似，所以推測(cè)CAGTCACTGGTCA可能是一個(gè)視黃酸／甲狀腺激素應(yīng)答元件，且由兩個(gè)同向重復(fù)(Direct Repeat，DR)的半位點(diǎn)組成，兩個(gè)半位點(diǎn)間隔為1，記作DR1。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示牙鲆ALP基因5’調(diào)控區(qū)序列與斑馬魚的組織非特異性ALP啟動(dòng)子具有同源性且更接近于哺乳動(dòng)物的組織非

8、特異性ALP啟動(dòng)子，啟動(dòng)子區(qū)域的分子進(jìn)化樹與cDNA進(jìn)化樹以及物種進(jìn)化樹基本一致。 為了進(jìn)一步證實(shí)牙鲆ALP基因5'調(diào)控區(qū)和第一個(gè)內(nèi)含子的啟動(dòng)子活性，采用DNA重組的方法，將克隆得到的ALP基因5'調(diào)控區(qū)、第一個(gè)內(nèi)含子序列插入到啟動(dòng)子缺失的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-1、螢光素酶報(bào)告基因載體PGL3-Basic中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體。重組的EGFP載體通過脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在倒置熒光顯微鏡下可