盾殼霉產(chǎn)抗細菌物質(zhì)相關(guān)基因的克隆及抗細菌物質(zhì)生態(tài)學(xué)功能的研究.pdf

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotirium)的重要寄生真菌,在世界范圍內(nèi)廣泛存在,是菌核病的一種重要生防菌。本文以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)為指示菌,對盾殼霉ZS-1菌株的T-DNA標記插入突變體庫,進行了產(chǎn)抗細菌物質(zhì)(ABS,Antibacterial substances)缺陷型突變體的篩選,以突變體ZS-1T1200

2、3為材料克隆到產(chǎn)抗生素相關(guān)的基因,并以該突變體為材料,對盾殼霉產(chǎn)生的ABS的生態(tài)學(xué)功能進行了研究,結(jié)果如下:
　　 從盾殼霉ZS-1菌株T-DNA標記插入突變體庫中篩選出的產(chǎn)ABS缺陷型突變體ZS-1T12003、ZS-1T24630及ZS-1T25680。ZS-1T12003產(chǎn)孢正常,生長速度及寄生致腐核盤菌菌核的能力與出發(fā)菌株ZS-1無顯著性差異(P<0.05),在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)；ZS-1T25680不產(chǎn)孢,

3、生長速度及寄生致腐核盤菌菌核的能力與ZS-1存在顯著性差異(P<0.05),在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生少量的抗真菌物質(zhì)；ZS-1T24630僅產(chǎn)少量的孢子,生長速度及寄生致腐核盤菌菌核的能力與ZS-1存在顯著性差異(P<0.05),在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)。
　　 Southern雜交證實T-DNA標記在突變體ZS-1T12003中為單拷貝插入；以ZS-1T12003為材料,采用TAIL-PCR和RT-PCR技術(shù)對T-DNA記

4、插入位點的基因組DNA進行了克隆,獲得了大小為1336bp的DNA片段；對該基因組DNA片段進行了序列分析,并利用GenScan軟件進行了閱讀框(ORF)預(yù)測:位于第77nt開始的ATG為起始密碼子,該DNA片段中含有一個完整的閱讀框:起始外顯子(77-328nt)；中間外顯子(454-588nt);末端外顯子(640-924nt),編碼223aa。對推定的氨基酸序列進行功能預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該序列中含有一保守的區(qū)域,即MADS-box域,故命

5、名該基因為CMMADS-box1。CMMADS-box1與其它真菌的MADS-box具有高度的同源性,如與大孢糞殼霉菌(Sordaria macrospora)的MADS-box相同部位等同的氨基酸為67％,類似的氨基酸達74％；T-DNA記破壞該基因的啟動子。
　　 Southern雜交證實CMMADS-box1基因在菌株ZS-1的基因組中為單拷貝；RT-PCR結(jié)果表明CMMADS-box1基因在ZS-1T12003基因組中不

6、表達,在菌株ZS-1的基因組中表達。構(gòu)建了CMMADS-box1基因敲除載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法,獲得了CMMADS-box1敲除轉(zhuǎn)化子03GDT02,該轉(zhuǎn)化子對水稻白葉枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)不具有拮抗活性,與ZS-1T12003表現(xiàn)出了相同的產(chǎn)ABS缺陷這一性狀；03GDT02、ZS-1及ZS-1T12003三菌株的菌落形態(tài)無顯著差別,在PDA培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)。
　　 為了研究盾殼霉產(chǎn)生

7、的ABS的生態(tài)學(xué)作用,并排除T-DNA標記插入的影響,從突變體庫中篩選到了一個突變體ZS-1T21559,其菌落形態(tài)、產(chǎn)ABS的能力、生長速度及寄生致腐核盤菌菌核的能力與出發(fā)菌株ZS-1沒有顯著性差異(P<0.05)；出發(fā)菌株ZS-1、突變體ZS-1T12003、ZS-1T21559的生長速度和產(chǎn)孢能力不存在顯著性差異(P<0.05)；在PDA培養(yǎng)基上與核盤菌菌株Ep-1PNAa對峙培養(yǎng)過程中,未見抑菌圈的產(chǎn)生；無菌條件下及在自然土中寄

8、生致腐核盤菌菌核的能力無顯著性差異(P<0.05)；ZS-1T12003與ZS-1T21559的孢子等量加入到放有菌核的自然土和滅菌土中的實驗表明:隨著培養(yǎng)時間的延長,ZS-1T12003每克菌核上的孢子量顯著低于ZS-1T21559每克菌核上的孢子量(P<0.05),這說明:ZS-1T21559與ZS-1T12003相比,表現(xiàn)出成活和競爭的優(yōu)勢；出發(fā)菌株ZS-1和突變體ZS-1T12003、ZS-1T21559三菌株在被核盤菌侵染的油