貝類三種組織血型抗原ELISA檢測(cè)方法的建立與季節(jié)變化規(guī)律研究.pdf

1、諾如病毒(Noroviruscs，NoVs)，屬于杯狀病毒科((Caliciviridae)，是一種引起非菌性急性腸胃炎的主要病原體，包括多種形態(tài)相似和基因型多樣的亞型。感染人類的諾如病毒有GGⅠ、GGⅡ和GGⅣ，它們分別各有15、18和1個(gè)亞型。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國諾如病毒每年大約引起2300萬例胃腸炎病例，占所有食源性疾病的50％-67％。研究結(jié)果表明人類組織血型抗原(histo-blood groupantigens，HBGAs)是No

2、Vs的結(jié)合受體。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人類HBGAs與人類諾如病毒或者與GⅠ或GⅡ的重組諾如病毒(rNVLP)的8種代表性的結(jié)合模式。HBGAs是復(fù)雜的碳水化合物，分布于紅細(xì)胞表面以及呼吸道、生殖道黏膜和消化道上皮細(xì)胞表面，同時(shí)也以游離低聚糖形式存在于唾液、腸內(nèi)容物、乳汁及血液等體液中。HBGAs的表達(dá)是由多基因系控制的，Lewis血型系統(tǒng)、分泌型和ABO血型系統(tǒng)是三種主要的人體HBGAs系統(tǒng)。
　　 NoVs引起的胃腸炎往往與食用了受

3、NoVs污染的生的或未烹飪完全的雙殼貝類有關(guān)，尤其是牡蠣。雙殼貝類是高風(fēng)險(xiǎn)的食物，因?yàn)樗鼈兪菫V食性動(dòng)物，很容易從污染的海水中富集大量的病毒粒子。研究表明重量為1kg的雙殼貝類每小時(shí)可以濾食90L，的海水。目前貝類富集NoVs的機(jī)理還不是十分確定，但富集過程涉及到機(jī)械性的包埋，包括直接化學(xué)鍵、范德華力、氫鍵以及其他形式的離子鍵。人類胃腸細(xì)胞上的HBGAs被認(rèn)為充當(dāng)了病毒粒子的受體。所以，我們假設(shè)，牡蠣中也可能存在類似的HBGAs并且特異性

4、的富集NoVs。人類的ABO血型系統(tǒng)已經(jīng)研究的比較清楚，在其他物種中類似的ABO碳水化合物抗原也有了報(bào)道。
　　 本論文利用人組織血型抗原單克隆抗體，研究建立了貝類中A、H型和B型HBGAs的ELISA檢測(cè)方法。通過設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，以P/N值作為判斷陽性的依據(jù)和貝類含量差異的定量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)我國六種貝類中的HBGAs進(jìn)行了檢測(cè)和分型，探究了不同城市不同季節(jié)的貝類中HBGAs的表達(dá)差異情況。主要研究結(jié)論如下：
　　 1、建

5、立了貝類中A、H型和B型HBGAs的EMSA檢測(cè)方法。A型、H型檢測(cè)方法確定的主要條件為：包被濃度和包被時(shí)間分別為1g：3mL、2h，單克隆抗體的工作濃度和反應(yīng)時(shí)間為1:1200、1.5h，二抗的反應(yīng)條件為37℃孵育2h；B型HBGAs的ELISA檢測(cè)方法確定的主要條件為：包被濃度和包被時(shí)間分別為1g：4mL、1h，單克隆抗體的工作濃度和反應(yīng)時(shí)間為1:400、1.0h，二抗的反應(yīng)條件為37℃孵育1.5h。
　　 2、檢測(cè)了我國9

6、個(gè)沿海城市6種貝類中的HBGAs的類型。對(duì)2011年不同季節(jié)從大連、煙臺(tái)、威海、青島、日照、連云港、舟山、廈門、廣州等9個(gè)城市采集的81份牡蠣、65份縊蟶、77份菲律賓蛤仔、57份紫貽貝、72份毛蚶、69份扇貝等貝類樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示上述六種貝類中都檢測(cè)出A型抗原，其中菲律賓蛤仔的檢出率為11.6％(9/77)，紫貽貝的檢出率為28.1％(16/57)，縊蟶樣品的檢出率為72.3％(47/65)，扇貝樣品的檢出率為84.6％(58

7、/69)，所有檢測(cè)的牡蠣和毛蚶樣品都含有A抗原；只有牡蠣樣品檢出H抗原，檢出率為30.7％(28/91)；縊蟶和毛蚶樣品都檢測(cè)出B型抗原，檢出率分別為76.9％(50/65)和77.8％(56/72)。
　　 3、初步分析了我國6種貝類中HBGAs隨季節(jié)的分布規(guī)律。在舟山、廈門和廣州這三個(gè)南方城市中，牡蠣樣品A抗原在10月-12月份的含量比較高；其中，舟山縊蟶樣品A抗原平均水平較高；舟山和廣州的扇貝樣品A抗原含量從7月份到12月

8、份呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在大連、煙臺(tái)、青島、日照這四個(gè)北方城市中，6月份左右含量較高；在大連、煙臺(tái)、威海、青島、日照這五個(gè)北方城市中，毛蚶樣品A型抗原冬季其含量較低，其最高的階段出現(xiàn)在夏季，在三個(gè)南方城市中，11月和12月份的含量相比其他月份都較高。
　　 本論文建立了貝類中三種HBGAs的ELISA檢測(cè)方法，分析了6種雙殼經(jīng)濟(jì)貝類中的三種HBGAs的類型，結(jié)果顯示貝類中的HBGAs不止一種類型，該研究結(jié)果拓展了對(duì)雙殼貝類表達(dá)HB