戊型肝炎病毒抗原肽的合成及ELISA檢測方法的建立和改良.pdf

1、戊型肝炎是一種經(jīng)糞一口途徑傳播的自限性病毒性肝炎,過去稱腸道傳播的非甲非乙型肝炎.其病原體為戊型肝炎病毒.根據(jù)中國流行地區(qū)及季節(jié)性散發(fā)的病例獲得的中國株HEV序列研究表明與其它型別的HEV存在差異.中國不但有HEV Ⅰ型還有HEVⅣ型的流行和散發(fā).而目前ELISA所采用的重組蛋白或是合成抗原肽都只含有HEV Ⅰ型的序列,這很顯然存在不足.國內(nèi)另有學者報道了HEVⅣ型表位的存在及作用.我們綜合上述的研究結(jié)果,采用S42、NS33以及HEV

2、Ⅳ型ORF2的SP12序列(PSGRRRGQAG CG)作為我們待建立的ELISA實驗方法的3段合成抗原肽.根據(jù)Merrifield的固相多肽合成方法(solid phase polypeptide synthesis SPPS),采用N-α-FMOC-氨基酸作為成份氨基酸,Wang樹脂為載體,以二異丙基碳二亞胺(DIC)作為縮合劑,加入復合添加劑1-羥基苯并三氮唑(HoBt),經(jīng)過脫保護→洗滌→縮合→洗滌,如此循環(huán)的合成路線,最后經(jīng)切

3、肽步驟獲得目標抗原肽的合成過程.合成獲得的粗品肽再經(jīng)過離子交換層析和反相高效液相(RP-HPLC)純化得到純度>95％的合成抗原肽.收集血清抗-HEVIgG與或IgM為陽性的和抗-HEVIgG與IgM為陰性的血清標本(美國Genelab公司Kit測定)以及健康獻血員血清.應(yīng)用棋盤實驗確定抗原最佳包被濃度、酶標抗體稀釋度和標本稀釋度.建立了合成抗原肽聯(lián)合包被檢測HEV抗體的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).結(jié)果顯示,建立的ELISA方法批內(nèi)

4、CV為5.71％,批間CV為9.0％,穩(wěn)定性保持6個月,與美國Genelab試劑盒的符合率也良好IgG、IgM分別為95.6％和90.6％,并且實驗證明在包被的合成多肽中加入SP12對于中國HEV流行現(xiàn)狀的檢測具有現(xiàn)實意義.但是和Genelab試劑盒進行比較時,也發(fā)現(xiàn)相同的陽性標本檢測吸光度值(OD)偏低(0.8~1.5),有顯著性差異(p<0.001).針對上述情況,我們采用Poly-l-ysine(PLL多聚賴氨酸)預先包板,然后再