大豆抗原蛋白對(duì)仔豬腸道的致敏作用及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、大豆中的抗原蛋白能引起機(jī)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，不僅威脅人類的健康，也給畜禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過(guò)高純度的大豆抗原蛋白致敏仔豬，研究大豆抗原蛋白對(duì)仔豬腸道的致敏作用，同時(shí)建立一種仔豬大豆抗原蛋白血清抗體間接酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)的檢測(cè)方法，以期為動(dòng)物大豆抗原蛋白致敏提供臨床診斷方法。
　　大豆抗原蛋白對(duì)仔豬腸道的致敏作用。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將30頭臨床檢查健康的21日齡斷奶仔豬隨機(jī)分為3個(gè)組，每組10頭，分別為對(duì)照組

2、、大豆球蛋白(11S)致敏組和β-伴大豆球蛋白(7S)致敏組。在仔豬21～27日齡與32～34日齡時(shí)，分別進(jìn)行初次致敏和再次致敏。其中，11S和7S致敏組，在基礎(chǔ)日糧中分別添加4％的11S蛋白和4％的7S蛋白（純度分別為80％和85％）。在仔豬21、28和35日齡時(shí)，用EDTA抗凝管進(jìn)行前腔靜脈采血，用于ELISA試劑盒測(cè)定血漿D-乳酸、二胺氧化酶和5-羥色胺含量水平;在仔豬35日齡時(shí)，進(jìn)行皮膚致敏試驗(yàn);在36日齡時(shí)，每組隨機(jī)選擇5頭仔

3、豬屠宰，取十二指腸近端、空腸近端、空腸中段、空腸遠(yuǎn)端、回腸遠(yuǎn)端各6 cm，用免疫組化方法測(cè)定分泌型IgA陽(yáng)性表達(dá)分布及強(qiáng)弱。
　　仔豬大豆抗原蛋白血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立。試驗(yàn)分組及處理方法同上。在21、28和35日齡時(shí)，每天上午7:00～8:00對(duì)所有試驗(yàn)仔豬空腹采血，室溫靜置2h后，3000 r·min-1離心10 min，分離血清，并在35日齡時(shí)做皮膚致敏試驗(yàn)。采用棋盤滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度及血清稀釋倍數(shù)

4、，并對(duì)其他條件進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)血清大豆抗原蛋白11S、7S抗體的間接ELISA方法，確立待測(cè)血清判定標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)建立的ELISA方法進(jìn)行重復(fù)性、準(zhǔn)確性和敏感性檢測(cè)。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.皮膚致敏試驗(yàn)后，所有致敏組仔豬11S和7S蛋白注射點(diǎn)皮膚反應(yīng)均較明顯，評(píng)判結(jié)果在“+”級(jí)以上，7S蛋白致敏組仔豬的反應(yīng)尤為明顯，評(píng)判結(jié)果達(dá)到“++”級(jí)以上，證明大豆抗原蛋白可使35日齡仔豬產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。
　　2.在28和35日齡

5、時(shí)，大豆抗原蛋白致敏組仔豬血漿D-乳酸含量水平、二胺氧化酶活力和5-羥色胺含量水平與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，結(jié)果表明血漿D-乳酸含量水平和二胺氧化酶活性與腸道損傷具有很強(qiáng)的相關(guān)性。對(duì)大豆抗原蛋白致敏仔豬血漿5-羥色胺含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5-羥色胺在機(jī)體內(nèi)隨著日齡的增加呈先低后高再低的趨勢(shì)，腸道生理功能的強(qiáng)弱與血漿5-羥色胺含量變化有一定的關(guān)系。
　　3.試驗(yàn)用免疫組化的方法，分別對(duì)仔豬的十二指腸、空腸近端、空腸中段、空腸

6、遠(yuǎn)端和回腸遠(yuǎn)端的分泌型IgA陽(yáng)性表達(dá)分布及強(qiáng)弱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)空腸中段陽(yáng)性分布和光密度值明顯高于其他各試驗(yàn)組腸段，7S致敏組仔豬陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度尤為明顯，其次是11S致敏組。小腸5段腸管中分泌型IgA陽(yáng)性表達(dá)光密度值從強(qiáng)到弱依次為:空腸中段＞十二指腸＞空腸近端、回腸遠(yuǎn)端＞空腸遠(yuǎn)端。
　　4.建立了仔豬血清大豆抗原蛋白間接ELISA檢測(cè)方法。其中，11S蛋白的最適包被質(zhì)量濃度為2.0μg·mL-1，包被作用時(shí)間為37℃下2h;封閉液為10

7、 g·L-1BSA，37℃封閉1 h;待測(cè)血清最適稀釋度為1∶1600，37℃作用1 h;酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1∶1500，37℃作用1 h;最佳顯色時(shí)間15min。7S蛋白的最適包被質(zhì)量濃度為2.5μg·mL-1，包被作用時(shí)間為37℃下2h;封閉液為10 g·L-1 BSA，37℃封閉1h;待測(cè)血清最適稀釋度為1∶1600，37℃作用1h;酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1∶1500，37℃作用1h;最佳顯色時(shí)間25 min。11S和7S抗原蛋白

8、間接ELISA檢測(cè)方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10％，重復(fù)性較好，靈敏度較高。
　　5.在臨床上對(duì)已建立的間接ELISA方法進(jìn)行敏感性和準(zhǔn)確性檢測(cè)，并確定11S抗原蛋白抗體的間接ELISA方法敏感性為87.5％(7/8)，準(zhǔn)確性為81.3％(13/16);7S抗原蛋白抗體的間接ELISA方法敏感性為87.5％(7/8)，準(zhǔn)確性為87.5％(14/16)。
　　試驗(yàn)表明，大豆抗原蛋白對(duì)仔豬腸道具有致敏作用，并能改變腸道的正常