大豆抗原蛋白對(duì)仔豬的致敏性和免疫原性的研究.pdf

1、大豆中存在的大豆抗原蛋白物質(zhì)，會(huì)引起畜禽尤其是幼齡動(dòng)物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，發(fā)生腹瀉甚至死亡，給畜禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過(guò)研究大豆球蛋白(11S)、β-伴球蛋白(7S)對(duì)小鼠和仔豬的致敏性和免疫原性，探討大豆過(guò)敏性疾病的早期診斷和防治方法及作用機(jī)理。
　　 大豆抗原蛋白的純化及注射液的制備。經(jīng)瓊脂糖凝膠層析對(duì)11S、7S抗原蛋白進(jìn)行純化，再透析及冷凍干燥。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)純化的11s、7S蛋白進(jìn)行檢測(cè)和分析。

2、應(yīng)用光密度法分析電泳圖片，并計(jì)算其純度。選用不同佐劑(弗氏佐劑、白油佐劑、氫氧化鋁膠體佐劑、PBS佐劑、蜂膠佐劑)與大豆抗原蛋白充分乳化，并進(jìn)行無(wú)菌和安全性檢驗(yàn)。
　　 大豆抗原蛋白對(duì)小鼠致敏性的研究及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法的建立。試驗(yàn)選取510只昆明鼠，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、弗氏佐劑處理組Ⅰ(7S)和處理組Ⅱ(11S)、白油佐劑處理組Ⅰ(7S)和處理組Ⅱ(11S)、氫氧化鋁佐劑處理組Ⅰ(7S)和處理組Ⅱ(11S)、PBS佐劑處理組Ⅰ

3、(7S)和處理組Ⅱ(11S)、蜂膠佐劑處理組Ⅰ(7S)和處理組Ⅱ(11S)，對(duì)照組10只，各處理組50只；對(duì)照組注射生理鹽水，處理組使用不同佐劑大豆抗原蛋白注射液；每個(gè)處理組再隨機(jī)分為5組，每組10只，每組注射大豆抗原蛋白量分別為500μg·Kg-1、1000μg·Kg-1、2000μg·Kg-1、3000μg·Kg-1和4000μg·Kg-1。首次免疫，取混合乳化后的大豆抗原蛋白，于小鼠頸背部皮下注射。10d后，同樣方法注射相應(yīng)抗原組

4、分(弗氏完全佐劑抗原蛋白注射液替換為弗氏不完全佐劑抗原蛋白注射液)，連續(xù)10d后重復(fù)1次。第三次注射完成10d后采血、分離血清，采用瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)；建立大豆抗原蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，確定7S蛋白和11S蛋白的免疫劑量、次數(shù)及免疫效果。
　　 大豆抗原蛋白對(duì)仔豬致敏性和免疫原性研究。試驗(yàn)選取70頭18日齡仔豬，將其隨機(jī)分為對(duì)照組，7S和11S致敏組，7S和11S免疫組，7S和11S處理組，共7組，每組1

5、0頭。在仔豬18、28日齡時(shí)，免疫組和處理組分別按體重1mg·Kg-1注射7S、11S蛋白；28～34日齡和39～41日齡時(shí)，致敏組和處理組，每組在基礎(chǔ)日糧中分別添加4％的7S、11S蛋白；28、38日齡時(shí)，采用瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)；46日齡進(jìn)行皮膚試敏試驗(yàn)；68日齡試驗(yàn)結(jié)束。采用生化、ELISA法檢測(cè)仔豬在不同采血時(shí)間點(diǎn)(28、38、48、58、68d)血清中IgG、IgG亞類的含量。探討大豆抗原蛋白致敏及免疫仔豬后血清中免

6、疫球蛋白IgG、IgG亞類含量的消長(zhǎng)規(guī)律。
　　 試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.經(jīng)瓊脂糖凝膠層析分別得到純化的11S、7S蛋白，其純度分別為90.6％、90.0％。大豆抗原蛋白注射液經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)、肌肉刺激試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)家兔腿部肌肉觀察，其肌肉完整、無(wú)充血現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆抗原蛋白經(jīng)肌肉給藥無(wú)刺激性反應(yīng)，安全度較高。
　　 2.免疫小鼠血清中的抗體效價(jià)均為1:16。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方陣滴定法確定

7、11S蛋白最佳包被濃度為5.0μg·mL-1，血清稀釋倍數(shù)為1:800；7S蛋白抗原最佳包被濃度為2.5μg·mL-1，血清稀釋倍數(shù)為1:1600；兩者的批內(nèi)、批間系數(shù)均小于10％，重復(fù)性較好，通過(guò)ELISA法確定11S和7S蛋白的最佳免疫次數(shù)為2次，免疫劑量為1000μg·Kg-1。7S和11S的最佳免疫佐劑分別為氫氧化鋁和白油。
　　 3.仔豬28日齡時(shí)血清效價(jià)較低，38日齡時(shí)的血清抗體效價(jià)均為1:16以上，表明7S和11S

8、均對(duì)仔豬產(chǎn)生免疫反應(yīng)；39-41日齡時(shí)仔豬致敏后出現(xiàn)輕度腹瀉癥狀；皮膚致敏試驗(yàn)顯示，7S或11S抗原蛋白致敏組注射點(diǎn)皮膚反應(yīng)均較明顯，評(píng)判結(jié)果均在“+”級(jí)以上，表明仔豬皮膚紅斑反應(yīng)呈不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)，通過(guò)皮膚試敏紅斑直徑大小，證明大豆抗原蛋白對(duì)46天仔豬產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。但處理組11S或7S注射點(diǎn)比致敏組反應(yīng)較輕，說(shuō)明免疫后再致敏能降低過(guò)敏反應(yīng)。
　　 4.大豆抗原蛋白對(duì)仔豬過(guò)敏后可引起血清中IgG1、IgG2、IgG4含量顯著升

9、高，11S致敏后引起總IgG變化不顯著，IgG4含量水平在整個(gè)免疫及致敏過(guò)程均顯著增加，可能是過(guò)敏反應(yīng)主要參與者。免疫后再次致敏，能明顯降低IgG及IgG亞類含量水平，降低過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，起到了免疫保護(hù)效果。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)得到高度純化大豆抗原蛋白用于小鼠、仔豬的致敏和免疫，建立檢測(cè)血清大豆抗原蛋白抗體的間接ELISA方法，利用該方法檢測(cè)小鼠免疫后血清抗體效價(jià)水平，得出小鼠免疫7S蛋白和11S蛋白的最適免疫劑量為1mg