己烯雌酚人工抗原的制備和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、己烯雌酚( diethylstibestrol，DES)是一種人工合成的雌激素。在養(yǎng)殖業(yè)中，DES作為一種動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑在提高動(dòng)物日增重和減少脂肪等方面效果明顯，但DES有致癌和致畸作用，世界各國(guó)均規(guī)定動(dòng)物及動(dòng)物性食品中不得檢出DES。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)簡(jiǎn)便快速、靈敏度高，是DES應(yīng)用監(jiān)控的一種重要手段。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于DES的ELISA檢測(cè)方法的研究大多是基于國(guó)外研究的基礎(chǔ)上，且用于檢測(cè)的ELISA試劑盒仍以國(guó)外的為主。本研

2、究是為研制具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的DES殘留免疫檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)，主要對(duì)DES衍生物制備、DES人工抗原合成、DES多克隆抗體抗制備及ELISA檢測(cè)方法等進(jìn)行了研究：
　　 1.己烯雌酚衍生物制備
　　 利用DES與琥珀酸酐反應(yīng)將DES的一個(gè)酚羥基?；婶然?，從而合成了DES人工半抗原(DES-HS)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振氫譜及紅外光譜鑒定。
　　 2.己烯雌酚人工抗原的合成及鑒定
　　 采用活性酯法將D

3、ES-HS與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原(DES-BSA)，混合酸酐法與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備包被原(DES-OVA)。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、紫外掃描圖譜鑒定交聯(lián)反應(yīng)成功，用紫外光譜法計(jì)算出DES-BSA的半抗原結(jié)合比是10:1。
　　 3.多克隆抗體制備與ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化
　　 用人工合成的免疫原DES-BSA免疫家兔，采集免疫動(dòng)物血清。對(duì)包被液、封閉液等因素進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用間接ELI

4、SA法檢測(cè)抗血清的效價(jià)為64000倍。用抗血清來(lái)建立檢測(cè)DES的Ci-ELISA法時(shí)，通過(guò)方陣實(shí)驗(yàn)確定了包被抗原(DES-OVA)的工作濃度是1.25ug/ml，抗血清的工作濃度為1:4000稀釋。
　　 4.間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Ci-ELISA法)的建立
　　 建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，回歸方程為y=-36.254x+128.43(R2=0.9854)，半數(shù)抑制量(IC50)為125.9ng/ml，