己烯雌酚單克隆抗體的研制及其ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、己烯雌酚(dicthylstibcstrol,DES)是一種人工合成的雌激素,由于其在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增加蛋白質(zhì)沉積、提高飼料轉(zhuǎn)化率和減少脂肪等方面作用明顯,因此曾作為促生長(zhǎng)劑被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)研究發(fā)現(xiàn),DES對(duì)人體具有致癌和致畸作用,因此,世界各國(guó)均規(guī)定養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES,但受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,當(dāng)前非法使用和濫用己烯雌酚的現(xiàn)象依然存在。
　　 目前,國(guó)內(nèi)外已建立了多種檢測(cè)DES殘

2、留的理化檢測(cè)方法,雖然此類方法較精確、靈敏,但均存在檢測(cè)成本高、儀器昂貴、周期長(zhǎng)和檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此研究開發(fā)成本低廉、檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品勢(shì)在必行。酶聯(lián)免疫吸附分析法正逐漸應(yīng)用于藥物的殘留檢測(cè),該類方法除具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)外,還有可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
　　 本研究采用單克隆抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等技術(shù),合成DES人工抗原,篩選制備出抗DES單克隆抗體,建立了檢測(cè)DES殘留

3、的ELISA檢測(cè)方法。
　　 首先對(duì)DES的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,通過一系列化學(xué)反應(yīng)及純化得到己烯雌酚-單-羧基丙基醚(DES-MCPE),采用混合酸酐法和碳二亞胺法分別與牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)共價(jià)偶聯(lián),制備了人工抗原DES-MCPE-BSA和DES-MCPE-HAS。紫外掃描和免疫學(xué)方法初步判定偶聯(lián)成功。
　　 選擇6～8周齡的BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫,研究了免疫方式、免疫劑量、載體蛋白及免疫次數(shù)

4、對(duì)免疫效價(jià)的影響。結(jié)果顯示:背部皮下逐步加強(qiáng)免疫比多次同劑量免疫免疫效價(jià)高;首免劑量100μg/只比50μg/只免疫效價(jià)高;BSA作載體免疫的血清效價(jià)及親和力顯著高于HAS載體;免疫五次后即可獲得較高的免疫效價(jià)。
　　 用活性酯法合成的DES-MCPE-BSA作為免疫原免疫小鼠,用混合酸酐法合成的DES-MCPE-HAS作為包被原,五免后陽(yáng)性血清效價(jià)達(dá)到1:256,000,利用雜交瘤技術(shù)獲得1株能穩(wěn)定分泌抗DES特異性單克隆抗體

5、的雜交瘤細(xì)胞株2F6。利用體內(nèi)誘生法將細(xì)胞株2F6接種到小鼠體內(nèi),制備了抗DES腹水,其蛋白濃度為37.4mg/mL,腹水效價(jià)達(dá)1:512,000。
　　 利用雜交瘤細(xì)胞株2F6的小鼠腹水單抗建立了檢測(cè)DES殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。方陣實(shí)驗(yàn)確定了包被原的最佳包被稀釋度為1:32,000,抗體的最佳工作濃度為1:64,000。在優(yōu)化條件下,建立了DES對(duì)包被原DES-MCPE-HAS和抗體結(jié)合反應(yīng)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制

6、曲線,線性方程為Y=-0.4657x+0.7373(R2=0.9925),IC50為4.16ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)表明,該單抗與內(nèi)源性β-雌二醇(E2)及其它常見禁用激素及抗菌藥物交叉反應(yīng)無交叉反應(yīng),與結(jié)構(gòu)類似物雙烯雌酚、己烷雌酚的交叉反應(yīng)率分別為2.14％和1.46％。
　　 將建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA初步應(yīng)用于豬肝臟組織和肌肉組織的添加回收試驗(yàn),樣品經(jīng)前處理后用于測(cè)定。當(dāng)豬肝、肌肉樣品處理液作8倍以上稀釋時(shí),樣品基質(zhì)干擾基本消