拉沙里菌素單克隆抗體的研制及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、拉沙里菌素(lasalocid，LAS)是由拉沙里鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種聚醚類離子載體抗生素，主要用于提高反芻動物飼料利用率和預(yù)防畜禽球蟲感染。但在實際生產(chǎn)中，由于LAS不合理使用，導(dǎo)致其在牛奶、雞蛋及動物組織中殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅人類的健康。
　　目前，檢測LAS殘留的方法主要是高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。然而這些傳統(tǒng)的儀器檢測不但需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的前處理，而且還需要專業(yè)的技術(shù)人員操作，這些因素都影響著樣品檢測的效率

2、和準(zhǔn)確度。ELISA檢測法是免疫學(xué)方法的一種，基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，具有高特異性和高靈敏性的特點，由于其檢測方法簡單、快速、高效且便于攜帶，所以適合大批量樣品的快速檢測。
　　本實驗采用活性酯法合成LAS完全抗原，經(jīng)透析、鑒定后免疫BALB/c小鼠，然后利用單克隆抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及小鼠體內(nèi)誘生腹水技術(shù)，制備出針對LAS的效價高、特異性強的抗體，并以此為基礎(chǔ)建立間接競爭ELISA工作方法。
　　1、LAS完全

3、抗原的合成與鑒定
　　LAS屬于半抗原，分子中含有羧基，采用活性酯法將分子中的羧基先與間隔臂分子中的氨基連接，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，然后再與載體蛋白(BSA、OVA)進行偶聯(lián)，使半抗原與載體蛋白之間形成一間隔臂。完全抗原經(jīng)過SDS-PAGE法、紫外掃描法和免疫學(xué)方法鑒定，結(jié)果表明LAS與載體蛋白偶聯(lián)成功。采用BCA試劑盒測得LAS-BSA和LAS-OVA蛋白濃度分別為2.54 mg/mL和2.42 mg/mL。
　　2、LAS單

4、克隆抗體的制備
　　以LAS-BSA為免疫原，免疫BALB/c小鼠，五免后小鼠血清效價在1∶12800。采用雜交瘤技術(shù)進行脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合，采用ELISA法和有限稀釋法篩選出一株可穩(wěn)定分泌針對LAS的抗體的單克隆細(xì)胞株C11，采用小鼠體內(nèi)誘生法制備了20 mL腹水，其蛋白濃度為33.39 mg/mL。交叉實驗結(jié)果顯示，與莫能菌素鈉、鹽霉素鈉、馬杜霉素胺、頭孢噻吩鈉和硫酸鏈霉素均無交叉反應(yīng)。
　　3、ELISA檢測方法

5、的建立
　　選用C11株單克隆細(xì)胞，采用小鼠體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體，建立檢測LAS的間接競爭ELISA法。包被原和腹水的最佳工作濃度分別是1∶400和1∶4000，LAS濃度在5～1000ng/mL時，線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.376x-0.2374(R2=0.9914)，IC50為90.22 ng/mL，LOD為6.04 ng/mL。
　　4、牛奶中LAS添加回收實驗
　　將牛奶樣品進行前處理，結(jié)果顯示樣品處