三種重要水生動(dòng)物病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立.pdf

1、根據(jù)GenBank登錄的斑點(diǎn)叉尾鲴病毒株ORF8基因序列，設(shè)計(jì)引物和Taqman熒光探針，建立了用于檢測斑點(diǎn)叉尾鲴病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法；對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，評(píng)估了該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性，并建立了絕對(duì)定量方法。特異性試驗(yàn)證實(shí)，該方法只能檢測到斑點(diǎn)叉尾鲴病毒，與真鯛虹彩病毒、蛙虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒等多種常見的水生動(dòng)物病毒沒有交叉反應(yīng)，具有高度的特異性。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，在3.3×10

2、1～3.3×107拷貝數(shù)之間有較好的線性關(guān)系(相關(guān)4系數(shù)=0.9983)，最少可檢測到33個(gè)拷貝的陽性質(zhì)粒，敏感度很高。同一樣品于試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間的重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，變異系數(shù)分別為0.7％和1.2％，重復(fù)性較好。該方法的檢測時(shí)間從核酸抽提到出具結(jié)果僅需3h。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測斑點(diǎn)叉尾鲴病毒方法具有特異性好、靈敏度高、檢測耗時(shí)短的特點(diǎn)，并且能對(duì)病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，不僅適合口岸進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫的需求，而且可以作為研究該病毒感

3、染過程的有力工具。 在GeBank中搜尋虹彩病毒蛙病毒屬主衣殼蛋白(MCP)基因序列并進(jìn)行多重比較后，利用其中的保守序列，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，建立了虹彩病毒蛙病毒屬實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。對(duì)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)估該檢測方法的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，利用10倍系列稀釋法檢驗(yàn)其靈敏度并與常規(guī)PCR做了比較。結(jié)果顯示，該方法對(duì)虹彩病毒蛙病毒屬成員(新加坡石斑魚虹彩病毒除外)的檢測有高度的特異性，與淋巴囊腫病毒、鱖魚傳

4、染性脾。腎壞死病毒、真鯛虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒等其他水生動(dòng)物病毒之間均無交叉反應(yīng)，有良好的特異性，檢測總DNA靈敏度為4.5×10-3pg/μL，比傳統(tǒng)PCR的敏感度高出100倍，可對(duì)低病毒含量的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線有極好的線性關(guān)系，且線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)為0.9984。組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2％和1.6％，有良好的重復(fù)性。與常規(guī)的PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量、可同時(shí)檢測大量樣品等優(yōu)

5、點(diǎn)，可用于出入境檢疫和動(dòng)物防疫監(jiān)督部門對(duì)虹彩病毒蛙病毒屬的疫情監(jiān)測。 根據(jù)GenBank中登錄的魚類神經(jīng)壞死病毒CP基因序列，選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和TaqMan熒光探針，通過對(duì)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了用于檢測的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。利用該方法檢測魚類神經(jīng)壞死病毒及其它多種常見的水生動(dòng)物RNA病毒，結(jié)果只能檢測到目的病毒，表明其具有良好的特異性。靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其最低檢測限可達(dá)1.2pg/μL的總RNA