實(shí)時(shí)熒光PCR檢測食品肉類種源方法研究.pdf

1、【目的】利用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立豬、牛、羊、雞和鴨肉種源定性檢測體系，以鑒別相關(guān)食品肉源成分并鑒定食品標(biāo)簽的真?zhèn)危辉跍?zhǔn)確定性基礎(chǔ)上，建立豬和雞源性食品相對定量體系，以甄別豬和雞肉類食品的輕微污染與故意摻假，并確定其摻雜摻假比例，為肉類食品安全監(jiān)督與執(zhí)法提供技術(shù)手段。
　　【方法】
　　1.食品中肉類種源定性檢測研究：以線粒體細(xì)胞色素b基因?yàn)閿U(kuò)增靶基因設(shè)計(jì)合成豬、牛、羊、雞和鴨肉五種肉源的特異性引物、探針，利用

2、非目標(biāo)肉類DNA模板檢測引物和探針的特異性，以10倍濃度稀釋的特異種源肉DNA模板檢驗(yàn)方法的靈敏度；自制模擬混合肉類樣品，檢測抗干擾能力及檢測限；并通過市售食品的檢測，驗(yàn)證食品肉類種源定性檢測體系的應(yīng)用能力。
　　2.食品中肉類種源相對定量檢測研究：分別以豬、雞單拷貝基因?yàn)閿U(kuò)增靶基因設(shè)計(jì)合成豬、雞源的引物、探針，利用非目標(biāo)肉類模板檢測引物、探針的特異性，自制含目標(biāo)肉的模擬肉類混合樣品測定體系的檢測限和抗干擾能力；制備豬源、雞源和肉

3、類通用基因的重組質(zhì)粒以構(gòu)建外標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定未知樣品中豬源和雞源Ct值和肉類通用基因Ct值求得各自拷貝數(shù)，以目的種源肉拷貝數(shù)與通用基因拷貝數(shù)的比值為參照判斷肉制品是否故意摻假以及摻假程度；利用自制模擬加工混合肉樣和市售食品檢測所建立體系的應(yīng)用能力。
　　【結(jié)果】
　　1．食品中肉類種源定性檢測研究：（1）所設(shè)計(jì)的五種引物探針，其擴(kuò)增目的片度長度為88-110bp。各種源體系與非目標(biāo)肉類無交叉擴(kuò)增，特異性好，可達(dá)到的靈敏度范

4、圍為1-7pgDNA。（2）通過模擬混合肉樣檢測，證實(shí)該五種檢測體系抗干擾能力高，檢測限低，可低至1%（w/w）。（3）通過市售食品的檢測，證實(shí)對于不同加工處理的肉制品，所建立定性體系皆可準(zhǔn)確檢測目的種源肉。
　　2.食品中肉類種源相對定量檢測研究：（1）所設(shè)計(jì)的豬源、雞源引物探針，其擴(kuò)增目的片度長度為分別為91bp、110bp。各種源體系與非目標(biāo)肉類無交叉擴(kuò)增，特異性好；通過模擬混合肉樣檢測，抗干擾能力高，檢測限為1%（w/w）

5、。（2）利用重組質(zhì)粒構(gòu)建外標(biāo)準(zhǔn)曲線，肉類通用基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.0066x+37.8346， R2=0.9987；豬源標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.2611x+41.0013，R2=0.9993；雞源標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.1247X+43.1488，R2=0.9996。（3）通過模擬加工混合肉樣的檢測，目標(biāo)肉類摻加量分別為5%、30%和50%的混合樣品經(jīng)定量體系檢測所得摻假量分別為11.03%、32.55%和53.24%；市售食品的

6、定量結(jié)果也與實(shí)際結(jié)果相近，證實(shí)該定量體系可以用來甄別污染與故意摻假以及衡量摻假程度。
　　【結(jié)論】
　　1.肉類種源的定性檢測研究表明，所建立的體系特異性好，靈敏度高，市場應(yīng)用能力強(qiáng)，可滿足對于不同市售食品中目標(biāo)肉類和非目標(biāo)摻假肉類的定性檢測需要，可用于鑒別相關(guān)食品肉源成分并鑒定食品標(biāo)簽的真?zhèn)巍?br>　　2.食品肉類種源的定量檢測研究顯示，針對單拷貝基因所設(shè)計(jì)的引物探針體系特異性高，能滿足定量檢測要求。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒建立