重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因?qū)θ橄侔㎝CF-7-ADR細(xì)胞的抑癌及化療增敏作用的研究.pdf

1、目的：研究重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因（inhibitor of growth4生長(zhǎng)抑制因子4）表達(dá)對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的抑癌和化療增敏效應(yīng)及分子機(jī)制。
　　方法：將攜有ING4基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad-ING4感染QBI-293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并進(jìn)一步將病毒純化及效價(jià)測(cè)定；RT-PCR法鑒定Ad-ING4基因在QBI-293A細(xì)胞、MCF-7/ADR細(xì)胞有效表達(dá)。分別采用CCK-8法測(cè)定ADM、5-FU

2、和CXT對(duì)MCF-7/ADR和MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50，確定MCF-7/ADR的多藥耐藥性。用CCK-8法測(cè)定感染重組腺病毒Ad-ING4后，ADM、5-FU和CXT對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50，觀察其逆轉(zhuǎn)效果。探討ING4的抑癌和化療增敏的機(jī)制實(shí)驗(yàn)分為5組：PBS陰性對(duì)照組、Ad-GFP空載體腺病毒組、Ad-ING4重組腺病毒組、ADR(多柔比星終濃度為3.0μg/mL)組、Ad-ING4+ADR(終濃度

3、為3.0μg/mL)組，應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法檢測(cè)各組ING4基因及蛋白質(zhì)在MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)；CCK-8（cell counting kit-8）法檢測(cè)各組MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）PI單染法和Annexin-V-PE/7-AAD雙熒光標(biāo)記法分別檢測(cè)各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況；RT-PCR和蛋白印跡法檢測(cè)各組MCF-7/ADR細(xì)胞中Bax、bcl-2和Survi

4、vin（生存素）等相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：腺病毒介導(dǎo)的ING4基因在MCF-7/ADR細(xì)胞中成功表達(dá)，ING4基因在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)并不缺失并且對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)；Ad-ING4和ADR對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯的生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用，Ad-ING4使MCF-7/ADR細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，F(xiàn)=129.294，P＜0.05。Ad-ING4聯(lián)合ADR對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和促

5、凋亡作用更明顯，培養(yǎng)至第4天，其生長(zhǎng)抑制率可達(dá)（73.13±3.78）%，顯著高于Ad-ING4組和ADR組的（19.29±1.53）%和（48.39±2.96）%，F(xiàn)=257.397，P<0.05；其凋亡率可達(dá)(26.48±3.13)%，顯著高于Ad-ING4組的（11.57±1.26）%和ADR組的（17.21±2.34）%，F(xiàn)=30.253，P=0.001。蛋白印跡法結(jié)果分析顯示，ING4基因和ADR能使Bax的表達(dá)增強(qiáng)；使bcl

6、-2和Survivin的表達(dá)下降。與其他組相比較，Ad-ING4聯(lián)合ADR上述效應(yīng)更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值為789.842、1070.079和287.565，P值均＜0.05。
　　結(jié)論：Ad-ING4在體外可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡，其對(duì)多柔比星的細(xì)胞毒作用具有增敏效應(yīng)，其機(jī)制可能不是直接下調(diào)耐藥相關(guān)基因MRP1、LRP、MDR1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而是與ING4降低bcl-2/Bax比值和抑制Survi