重組人P53腺病毒注射液聯(lián)合化療藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7聯(lián)合抗增殖作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：乳腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年上升，女性面臨著嚴(yán)重的健康威脅。隨著醫(yī)學(xué)對(duì)乳腺腫瘤的研究不斷深入，及各學(xué)科不斷的發(fā)展，目前對(duì)于乳腺癌有著規(guī)范及系統(tǒng)的治療，即包含手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及HER2分子靶向治療的綜合治療。而基因P53自1979年首次報(bào)道以來，一直是研究的熱點(diǎn)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)野生型P53有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定等功能，且半數(shù)以上的惡性腫瘤存在P53基因的突變。所以2003年上市了世界范圍內(nèi)首個(gè)基因治療藥物重組人 P5

2、3腺病毒注射液（recombinant human Ad-P53，rAd-P53，又名今又生），其機(jī)制是將外源性P53以改構(gòu)的5型腺病毒為載體進(jìn)入增殖的腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其阻滯生長、促進(jìn)凋亡、促進(jìn)化療及放療療效、抑制血管生長等作用。已被證實(shí)應(yīng)用于頭頸鱗癌有較好的療效，對(duì)于乳腺癌的研究較少。本文通過研究rAd-P53與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用，探究兩者是否有聯(lián)合抗增殖、促凋亡作用，繼而研究其相關(guān)基因表達(dá)變化，以了解其作用

3、機(jī)制。此研究為rAd-P53與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療乳腺癌提供初步理論依據(jù)。
　　方法：首先將rAd-P53和化療藥物阿霉素（adriamycin,ADM）、順鉑（cis-diamine dichloroplatinum，CDDP）聯(lián)合作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞株96h后，采用水溶性四唑鹽（WST）比色法在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 OD450nm處測(cè)量每孔的吸光值，通過CalcuSyn軟件檢測(cè)兩者之間是否有協(xié)同作用，基于WST結(jié)果計(jì)算結(jié)合指數(shù)

4、（combination index,CI）和單獨(dú)成分影響（fractions affected,Fa），CI<1、CI=1、CI>1分別表達(dá)兩者之間具有協(xié)同、相加、拮抗作用。選取具有協(xié)同作用的各藥物濃度范圍內(nèi)一濃度，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的周期分布變化情況。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)rAd-P53和化療藥物單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)

5、用后相關(guān)促凋亡基因的變化。
　　結(jié)果：
　　1.rAd-P53聯(lián)合化療藥物ADM及CDDP對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7具有協(xié)同抗增殖作用。
　　以空白對(duì)照組的存活率做為100％，各rAd-P53濃度（由低到高依次為3×102U/cell、1×103U/cell、3×103U/cell、1×104U/cell、3×104U/cell、1×105U/cell、3×105U/cell），ADM濃度（由低到高依次為0.003μM、

6、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM），CDDP濃度（由低到高依次為0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM）作用MCF-7細(xì)胞株96h后，用WST比色法檢測(cè)不同藥物濃度下細(xì)胞存活率及生長抑制率，繪制增殖曲線，經(jīng)CalcuSyn軟件分析，rAd-P53聯(lián)合化療藥ADM時(shí)，F(xiàn)a在0.2-0.6之間， CI<1，表明兩者對(duì)乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7具有協(xié)同抗增殖作用；rAd-P53聯(lián)合化療藥CDDP

7、時(shí)，F(xiàn)a在0.2-0.6之間，CI<1，表明兩者對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7也具有協(xié)同抗增殖作用。
　　2.rAd-P53聯(lián)合化療藥物ADM或CDDP誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7發(fā)生細(xì)胞周期變化。
　　以無處理組為空白對(duì)照組，分別以 rAd-P53（1×104U/cell），ADM（0.2μM）,CDDP（2μM）作用于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞96h后，收取、固定細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，三組單獨(dú)用藥組 subG1期均較對(duì)照組增高

8、（分別為對(duì)照組0.17%，ADM組1.37%，CDDP組0.74%，rAd-P53組0.80%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示在單獨(dú)用藥的情況下，三種藥物均具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用rAd-P53分別聯(lián)合ADM或CDDP作用于乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)96h，收取、固定細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，聯(lián)合用藥各組 subG1期均較單獨(dú)用藥組增高（分別為ADM+rAd-P53聯(lián)合用藥組14.02%，CDDP+rAd-P53聯(lián)合用

9、藥組10.31%），與對(duì)照組及單獨(dú)用藥各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.rAd-P53聯(lián)合化療藥物可調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的P53、P21、P27、Bax、Noxa基因的表達(dá)水平。
　　將MCF-7細(xì)胞分為6個(gè)組，分別為：對(duì)照組、rAd-P53組（1×104U/cell）、ADM組（0.2μM）、CDDP組（2μM）、rAd-P53+ADM聯(lián)合用藥組、rAd-P53+CDDP聯(lián)合用藥組，作用于乳腺癌

10、細(xì)胞株MCF-7，培養(yǎng)96h，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測(cè)基因P53、P21、P27、Bax、Noxa表達(dá)水平。結(jié)果顯示：rAd-P53組及各個(gè)聯(lián)合用藥組 P53基因表達(dá)水平均較對(duì)照組、ADM組及 CDDP組增高（P<0.05）。各聯(lián)合用藥組與rAd-P53組相比基因P53表達(dá)量明顯增高（P<0.05）。P21基因單獨(dú)用藥組相比對(duì)照組，表達(dá)均增高（P<0.05），各聯(lián)合用藥組均較單一用藥組表達(dá)水平增高（P<0.05

11、）。P27基因各單藥組較對(duì)照組表達(dá)均增高（P<0.05）， ADM+rAd-P53聯(lián)合用藥組、CDDP+rAd-P53聯(lián)合用藥組均較單獨(dú)用藥組表達(dá)水平增高（P<0.05）。Bax基因在 CDDP+ rAd-P53聯(lián)合用藥組、ADM+rAd-P53聯(lián)合用藥組中，表達(dá)水平均高于各單一用藥組及對(duì)照組（P<0.05）。rAd-P53+ADM聯(lián)合用藥組Noxa表達(dá)水平均較對(duì)照組及ADM組高（P<0.05），CDDP+rAd-P53聯(lián)合用藥組Nox