三種不同蛋白構(gòu)型GnRH主動免疫對大鼠生殖性能的影響.pdf

1、在動物生產(chǎn)中通常采用外科閹割手術(shù)對動物進(jìn)行去勢，以去除公豬肉中的“膻味”(boar-taint)，避免肉牛生產(chǎn)中母畜的意外懷孕、防止公畜的攻擊行為和性行為，便于動物管理及控制流浪動物（貓和狗）的數(shù)量。然而，傳統(tǒng)外科閹割存在引起動物高度應(yīng)急、外科傷口易感染、增加動物發(fā)病率與死亡率，降低動物生產(chǎn)效率、不能滿足動物福利要求等諸多不足，GnRH主動免疫可抑制動物生殖性能并可避免外科閹割所引起的諸多不足，已成為最有望代替外科閹割的動物去勢技術(shù)。<

2、br>　　促性腺激素釋放激素(GnRH)是一種由下丘腦分泌的十肽激素，僅含九種氨基酸，分子量小，免疫原性弱。為提高其免疫原性，可通過改變GnRH的分子構(gòu)型，使其成為更易于被動物機體免疫系統(tǒng)識別的非自身物質(zhì)(nonself molecular);或?qū)nRH與載體蛋白偶聯(lián)，成為大分子“物質(zhì)”。本研究擬用D型賴氨酸取代GnRH第6位的甘氨酸的GnRH并列體二聚物(G6K-GnRH-Tandem-dimer: TDK)及GnRH并列體（G6K

3、-GnRH-Tandem: TK）、GnRH并列體二聚物(G6K-GnRH-Tandem-dimer.TDK)與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)形成的TK-OVA、TDK-OVA為抗原，以Specol為佐劑，系統(tǒng)研究三種不同蛋白構(gòu)型GnRH主動免疫對大鼠生殖性能的影響，為以后研制高效低廉的GnRH免疫去勢疫苗提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　試驗選取60只5-6周齡、體重150-210g的健康SD雄性大鼠，隨機分為五個組:不做任何處理的完整對照組、

4、免疫注射前兩周進(jìn)行外科閹割的手術(shù)去勢組、G6K-GnRH-Tandem-dimer(TDK)免疫組、G6K-GnRH-Tandem-OVA(TK-OVA)免疫組和G6K-GnRH-Tandem-dimer-OVA(TDK-OVA)免疫組，每組各12只。7周齡時每個免疫組雄鼠于腿部肌肉注射1ml含相應(yīng)免疫原的Specol乳化劑（各含不同構(gòu)型GnRH蛋白100μg），8周后加免，注射劑量及方法同初次免疫。初次免疫當(dāng)天定為0WPV(weeks

5、 of post vaccination)，初免當(dāng)天及初免后2、4、6、8、10WPV尾動脈采集血樣，12wpv摘除眼球采集血樣，分離血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法測定血清抗GnRH抗體滴度、激素含量。加免后4周(即12wpv)采用斷頸法處死所有試驗鼠，采集垂體和睪丸組織（測量垂體、睪丸重量及睪丸體積）用于相關(guān)生殖基因表達(dá)檢測及睪丸組織學(xué)分析。。
　　TDK、TK-OVA和TDK-OVA免疫后均能產(chǎn)生抗體反應(yīng)，加免后抗體滴度迅速上升，直

6、至試驗期末。在整個試驗期內(nèi)，TK-OVA和TDK-OVA免疫組抗體滴度相似，均顯著高于TDK免疫組(p＜0.05)。處死時，TK-OVA免疫組抗體滴度（12.31ng/ml）顯著高于TDK-OVA免疫組(10.18ng/ml)(p＜0.05); TK-OVA與TDK-OVA主動免疫后嚴(yán)重抑制睪丸的發(fā)育，處死時睪丸重量分別為對照組的30％和50％(p＜0.05)，盡管TDK免疫后睪丸重量與對照組差異不顯著(1.50gVs1.65g)，但有

7、減少的趨勢(p＞0.05)，睪丸組織學(xué)分析，TDK、TK-OVA和TDK-OVA主動免疫后睪丸組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，其中TK-OVA和TDK-OVA免疫組睪丸組織結(jié)構(gòu)以退化的精原細(xì)胞為主，無各級生精細(xì)胞，精子發(fā)生終止，TDK免疫組睪丸組織中雖還有各級生精細(xì)胞的存在，但數(shù)量顯著減少，且排列稀松。與對照組（LH、FSH、T平均值分別為13.21pg/ml，14.56pg/ml和3.36ng/ml）相比，TK-OVA免疫組和TDK-OVA免疫組

8、血清LH、FSH和T濃度在初免后顯著降低，加免后均下降到檢測限水平直至試驗結(jié)束(p＜0.05)，處死時，TK-OVA免疫組血清LH、FSH和T濃度（分別為0.60pg/ml，0.81pg/ml和0.20ng/ml）低于TDK-OVA免疫組（分別為1.18pg/ml，1.35pg/ml和0.37ng/ml）;TDK免疫組血清LH、FSH和T濃度雖然在初免后至8wpv降低不明顯(p＞0.05)，但在加免后顯著降低并在試驗結(jié)束時仍維持較低水平

9、（分別為6.75pg/ml，6.86pg/ml和1.24ng/ml）(p＜0.05);手術(shù)去勢組大鼠血清中LH和FSH濃度在整個試驗期間維持高水平穩(wěn)態(tài)（平均值分別為26.66pg/ml和25.80pg/ml），顯著高于對照組和三個免疫組。與對照組相比（設(shè)定基因表達(dá)水平均為1），三種不同蛋白構(gòu)型GnRH主動免疫均顯著下調(diào)大鼠垂體中GnRHR、LH-β、FSH-β及睪丸中LHR、FSHR mRNA表達(dá)水平(p＜0.05)，其中TK-OVA免

10、疫組（分別為0.12，0.12，0.13，0.12，0.21）基因表達(dá)水平與TDK-OVA免疫組（分別為0.13，0.15，0.15，0.18，0.23）相似(p＞0.05);TDK免疫組相應(yīng)基因表達(dá)水平（分別為0.27，0.37，0.24，0.47，0.62）的下調(diào)幅度低于TK-OVA免疫組和TDK-OVA免疫組，而手術(shù)去勢顯著上調(diào)大鼠垂體中GnRHR、LH-β、FSH-β基因表達(dá)水平（分別為2.51，3.65，3.27）(p＜0.0