MBP主動(dòng)免疫對(duì)出血性卒中保護(hù)機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分髓鞘堿性蛋白主動(dòng)免疫：上調(diào)效應(yīng)性T胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)出血性卒中大鼠的康復(fù) 目的：應(yīng)用髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠進(jìn)行免疫注射，通過測(cè)定大鼠腦組織中的神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)，觀察MBP對(duì)出血性卒中

2、的保護(hù)作用。同時(shí)測(cè)定脾臟中某種免疫性T細(xì)胞的特異性基因片段的表達(dá)，探討MBP神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。 方法： 1動(dòng)物分組及飼養(yǎng)：健康成年雌性SD大鼠，90只，體重300a±20g。造模成功(Longa五級(jí)評(píng)分大于2分者視為成功)后隨機(jī)分為MBP免疫組、磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebuffered saline，PBS)組、卵白蛋白(ovalbumin，OVA)組每組各30只，各組分為1d，3d，7d，14d，21d，五

3、個(gè)亞組，每亞組6只。其中PBS組和OVA組為MBP免疫組的對(duì)照組。為同一條件下飼養(yǎng)。 2動(dòng)物模型及取材：大鼠腹腔注射麻醉后，在尾動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血，應(yīng)用立體定位技術(shù)，在鼠腦的右側(cè)基底節(jié)區(qū)注射自體尾動(dòng)脈血50μl模。麻醉清醒后參照Longa五級(jí)評(píng)分法[1]評(píng)分，立即用不完全性弗氏佐劑乳化的MBP、OVA、PBS在相應(yīng)組別大鼠的腳蹼進(jìn)行皮下注射。每天進(jìn)行Longa評(píng)分，不同亞組按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。常規(guī)麻醉，胸腹腔聯(lián)合切開，結(jié)扎脾臟動(dòng)靜脈后

4、，摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心臟，經(jīng)左心室插管，用4％多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速斷頭取腦，取腦出血周圍組織，在4％的多聚甲醛中固定24h后，進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋。 3.結(jié)果測(cè)定：a.免疫組化取出血腫周圍腦組織，分別進(jìn)行GFAP和BDNF的免疫組化檢查。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PC

5、R)取脾組織制作勻漿，提取RNA，RT-PCR產(chǎn)物半定量，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。計(jì)算Foxp3與β-actin的相對(duì)密度值，以此代表目的片斷的相對(duì)表達(dá)值。 4 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD檢驗(yàn)；腦組織免疫組化結(jié)果比較采用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.MBP組大鼠與OV

6、A組及PBS組在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用Longa氏五級(jí)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，顯示前者高于后兩者并有顯著差異(P＜0.05)，而且MBP組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)時(shí)間較對(duì)照組早，OVA組與PBS組比較未見顯著差異； 2.GFAP和BDNF的表達(dá)，二者在各組中均為第一天最高，之后各天逐漸下降。但MBP組均高于相應(yīng)對(duì)照組(GFAP指標(biāo)P＜0.01，BDNF指標(biāo)P＜0.05)，說明效應(yīng)性T細(xì)胞活性增加。OVA組與PBS組比較未見顯著差異；

7、 3.Foxp3mRNA在MBP干預(yù)組干預(yù)組的大鼠脾臟中的表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組比較，均表達(dá)減低，且有明顯差異(P＜0.01)。OVA組與PBS組比較未見顯著差異； 結(jié)論： 1.MBP對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血后大鼠的行為學(xué)缺損有治療作用，可減輕癥狀。 2.MBP能上調(diào)BDNF，GFAP蛋白表達(dá)水平，對(duì)血腫周邊神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，3 MBP對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠進(jìn)行干預(yù)，降低FoxpmRNA的表達(dá)4 MBP的免疫保護(hù)機(jī)制是直接上調(diào)

8、CD4+Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且下調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CD4+Th1細(xì)胞的抑制作用。促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。 第二部分多巴胺：下調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，促進(jìn)出血性卒中大鼠的恢復(fù) 目的：應(yīng)用Dopamine對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠進(jìn)行腹腔注射，觀察CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷恢復(fù)的抑制作用，研究多巴胺(Dopamine)對(duì)出血性卒中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。 方法： 1.動(dòng)物分

9、組及飼養(yǎng)：健康成年雌性SD大鼠90只，體重300±20g，造模成功(Longa五級(jí)評(píng)分大于2分者視為成功)后隨機(jī)分為Dopamine治療組、生理鹽水(NS)對(duì)照組(N=30)，各組分為1d，3d，7d，14d，21d，五個(gè)亞組，每組6只。同一條件下飼養(yǎng)。 2.動(dòng)物模型及取材：大鼠腹腔注射麻醉后，在尾動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血，應(yīng)用立體定位技術(shù)，在鼠腦的右側(cè)基底節(jié)區(qū)注射自體尾動(dòng)脈血50μl造模。麻醉清醒后參照Longa五級(jí)評(píng)分法[1]評(píng)分，立

10、即用Dopamine和生理鹽水給相應(yīng)組別大鼠進(jìn)行腹腔注射。每天進(jìn)行Longa評(píng)分，不同亞組按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。常規(guī)麻醉，胸腹腔聯(lián)合切開，接扎脾臟動(dòng)靜脈后，摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心臟，經(jīng)左心室插管，用4％多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速斷頭取腦，取腦出血周圍組織，在4％的多聚甲醛中固定24h后，進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋。 3.結(jié)果測(cè)定：a.免疫組化取出血周圍腦組織，分別測(cè)GFAP(膠質(zhì)纖維酸

11、性蛋白)和BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)的免疫組化評(píng)分。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction， RT-PCR、)取脾組織制作勻漿，提取RNA， RT-PCR產(chǎn)物半定量，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。計(jì)算Foxp3與β-actin的相對(duì)密度值，以此目的片斷的相對(duì)表達(dá)值，表達(dá)CD4+CD25+T細(xì)胞的活性。 4

12、數(shù)據(jù)資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)；腦組織免疫組化評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.Dopamine組大鼠與NS組在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用Longa氏五級(jí)評(píng)分法[1]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，結(jié)果顯示前者高于后兩者并有顯著差異(P＜0.05)，而且Dopamine組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)時(shí)間較對(duì)照組早。 2.GFAP和BDNF在實(shí)驗(yàn)大鼠腦中的

13、表達(dá)，二者在各組中均為第一天最高，之后各天逐漸下降。Dopamine組均高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.01)。 3.Foxp3mRNA在Dopamine組的大鼠脾臟中的表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組比較，均表達(dá)減低，且有明顯差異(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)有抑制作用。 2.在實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦內(nèi)BDNE，GDNF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Dopamine能上調(diào)BDNF, GDN