重組人肝再生增強因子反式激活作用的研究.pdf

1、目的:(1)應用抑制性削減雜交技術篩選重組人肝再生增強因子(rhALR)反式激活的基因，探討rhALR刺激肝細胞再生的作用機制； (2)研究重組人肝再生增強因子(rhALR)對細胞周期蛋白依賴性激酶1(cdk1)基因的反式激活作用。 方法:(1)應用大腸桿菌系統，表達、純化重組人肝再生增強因子蛋白.體外刺激HepG2細胞，以溶劑pH7.8的磷酸鹽緩沖液為平行對照，制備作用后的細胞裂解液，提取mRNA并逆轉錄為cDNA，經Rsa

2、 Ⅰ酶切后，將實驗組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對照組cDNA進行兩次消減雜交及兩次抑制性聚合酶鏈反應(PCR)，將產物與T/A載體連接，構建cDNA消減文庫，并轉染大腸桿菌進行文庫擴增，隨機挑選克隆PCR擴增后進行測序及同源性分析。(2)聚合酶鏈反應(PCR)擴增人cdk1基因啟動子，命名為cdk1P。以T-A克隆法，將cdk1P基因片段連入載體pGEM-T。將獲得的質粒pGEMT-CDK1P，與報告質粒pCAT3

3、-basic分別用KpnI和Xhol Ⅰ雙酶切后構建cdk1啟動子報告基因表達載體pCAT3-cdk1P，以重組表達質粒pCAT3-cdk1P瞬時轉染HepG2細胞，然后用rhALR刺激，以轉染pCAT3 basic的HepG2細胞為陰性對照，48h后收獲細胞。用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞中氯霉素乙酰轉移酶(CAT)的表達活性，以了解重組人肝再生增強因子與cdk1基因表達的關系。 結論:(1)篩選到的cDNA全長序列，