Mn-SOD在乳酸乳球菌中的表達(dá)及雙歧桿菌染色體整合質(zhì)粒載體的構(gòu)建.pdf

1、目的： 構(gòu)建含錳超氧化物歧化酶基因的原核高效表達(dá)質(zhì)粒pBV220-sod并在乳酸乳球菌(MGl363)中表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建雙歧桿菌整合質(zhì)粒載體，為下一步SOD發(fā)酵奶的研制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1)根據(jù)GenBank中報(bào)道的大腸桿菌MGl655全基因組DNA序列中SOD的編碼基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增大腸桿菌錳超氧化物歧化酶基因，并將其克隆入原核高效表達(dá)質(zhì)粒載體pBV220中構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV220-sod。

2、 2)優(yōu)化乳酸乳球菌MGl363的電轉(zhuǎn)化條件，并在此條件下將重組質(zhì)粒pBV220-sod電轉(zhuǎn)入MGl363中。用黃嘌呤氧化酶法對(duì)SOD的表達(dá)活性進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用SDS-PAGE觀察SOD的表達(dá)量。 3)以雙歧桿菌基因組DNA為模板，根據(jù)16SrRNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆入質(zhì)粒pBV220-sod中構(gòu)建出整合質(zhì)粒載體pBV220-sod-bif。 結(jié)果： 1．成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV

3、220-sod，經(jīng)酶切和PCR鑒定后與預(yù)期結(jié)果吻合。核酸序列測(cè)定顯示插入的soda基因與GenBank報(bào)道的序列完全一致。 2．優(yōu)化了乳酸乳球菌MGl363的電轉(zhuǎn)化條件，確定了最佳參數(shù)：電壓10kV／cm，電阻20012，電容25gF，時(shí)間4．5～5．Oms，利用電轉(zhuǎn)化成功地將重組質(zhì)粒pBV220-sod導(dǎo)入MGl363中。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)得SOD的表達(dá)活性約683．7NU／mgprot。SDS-PAGE顯示SOD的表達(dá)量有