豬源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌及其噬菌體的分離和生物學(xué)特性研究.pdf

1、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是一類(lèi)引起人和初生動(dòng)物患病的重要病原菌。人或動(dòng)物被ETEC感染后，常因嚴(yán)重腹瀉和脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率都很高，給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全領(lǐng)域帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)從150份市售豬肉樣品和養(yǎng)殖場(chǎng)豬糞中分離ETEC，通過(guò)生理生化指標(biāo)和分子生物學(xué)手段鑒定該菌株，利用特異性引物分離ETEC單菌落并進(jìn)行純化，以分離得到的單菌落為宿主菌，篩選裂解性噬菌體，

2、然后考察噬菌體的生物學(xué)特性，為噬菌體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　將豬肉樣品用均漿機(jī)打碎并稀釋?zhuān)i糞樣品預(yù)處理后在腦心浸出液肉湯中增菌，然后涂布于選擇性培養(yǎng)基麥康凱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。分離純化后的優(yōu)勢(shì)菌菌落顏色為桃紅色，菌落形態(tài)呈表面隆起、邊緣整齊、光滑、圓潤(rùn)等特征。然后，提取混合菌液的總DNA，用設(shè)計(jì)合成的5種引物和探針，進(jìn)行 MRT-PCR反應(yīng)，對(duì)于陽(yáng)性樣品保留作下一步的實(shí)驗(yàn)；將PCR擴(kuò)增獲得的16S rDNA片段（1436bp）進(jìn)

3、行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明與大腸桿菌屬有99%的同源性，可以判定為大腸桿菌屬。對(duì)陽(yáng)性混合菌液中的疑似ETEC進(jìn)行生理生化鑒定，分離的致病菌具有運(yùn)動(dòng)性，能夠分解代謝鳥(niǎo)氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸、尿素、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、蜜二糖、棉子糖，不能分解代謝山梨醇、核糖醇。利用LT基因、ST基因的引物進(jìn)行特異性PCR反應(yīng)，從陽(yáng)性混合菌樣品中分離ETEC單菌落并純化，對(duì)分離得到的ETEC進(jìn)行耐藥性分析以及外膜囊泡的分離鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證其特征。結(jié)果表明，150

4、個(gè)豬源樣品中共分離得到7株ETEC，其中3株只攜帶LT基因，2株只攜帶ST基因，2株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因，可以初步判定其中2株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因的ETEC的致病性比其他菌株強(qiáng)。對(duì)分離得到的ETEC進(jìn)行耐藥性分析，選擇10種常用的抗生素，檢測(cè)ETEC菌株的耐藥性，結(jié)果表明，ETEC對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林極度敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素高度敏感，對(duì)氯霉素、多西環(huán)素中度敏感，對(duì)多粘菌素B和慶大霉素產(chǎn)生抗性。采用超濾離心法

5、分離ETEC產(chǎn)生的外膜囊泡，并用透射電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，ETEC的外膜囊泡約為100 nm，呈圓形或橢圓形。
　　利用兩株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因的ETEC-1和ETEC-2作為宿主菌，采集養(yǎng)殖場(chǎng)和醫(yī)院的廢水，經(jīng)離心、過(guò)濾等處理得到ETEC-1的噬菌體原液；將噬菌體原液接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液中培養(yǎng)，過(guò)濾除菌，得到高效價(jià)噬菌體增殖液。通過(guò)雙層平板法分離純化得到兩株噬菌體，命名為PES-1和PES-2。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，分離

6、的兩株噬菌體（PES-1和PES-2）屬于長(zhǎng)尾科噬菌體（Siphoviridae）。通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)、一步生長(zhǎng)曲線、pH、溫度穩(wěn)定性、氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)，以及噬菌體顆粒濃縮來(lái)確定噬菌體的生物學(xué)特性。提取噬菌體基因組DNA，進(jìn)行酶切反應(yīng)，參與酶切的限制性?xún)?nèi)切酶：Xho I、EcoR I、BamH I、HindIII。酶切實(shí)驗(yàn)表明，PES-1的基因組為線性DNA，PES-2的基因組DNA為環(huán)形。PES-1的裂解能力優(yōu)于PES-2，PES-1和P

7、ES-2共同作用時(shí)，可以顯著抑制病原菌的生長(zhǎng)。
　　將 SDS和膽鹽按照不同的濃度梯度加入噬菌體與宿主菌中，測(cè)定其菌液的 OD600的值，與只加噬菌體和只加抗生素的空白對(duì)照組作對(duì)比，結(jié)果表明，SDS和膽鹽都使噬菌體的裂解能力有不同程度的下降；如果將噬菌體口服灌胃施用，膽鹽作為哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)分泌物，噬菌體必會(huì)受到膽鹽的影響，因此，噬菌體口服施用時(shí)應(yīng)包被。噬菌體—抗生素聯(lián)合應(yīng)用是控制耐藥菌感染、控制菌株抗性進(jìn)化的有效方法。將不同濃度的