大腸桿菌菌蛻技術(shù)及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、菌蛻技術(shù)(bacterial ghost technology)是指在革蘭氏陰性細菌細胞內(nèi)可調(diào)控地表達大腸桿菌噬菌體FX174的溶菌基因E，從而引起宿主菌細胞裂解(溶菌)的一項基因工程技術(shù)。溶菌基因E的表達產(chǎn)物在宿主細胞的細胞膜和細胞壁上形成一個40-200 nm直徑的跨膜孔道，細胞質(zhì)、核糖體、核酸等細胞內(nèi)容物在滲透壓作用下從這個跨膜孔道流出細胞，如此形成的缺少細胞漿和核酸的、死的(無繁殖力的)細菌空殼就被稱為菌蛻(bacterial

2、ghosts，BGs)。E基因介導(dǎo)制備的菌蛻實際上是在非變性條件下滅活的細菌細胞，因此是優(yōu)良的候選滅活菌體疫苗，而且在作為遞呈異源蛋白抗原、DNA疫苗甚至藥物的載體方面也呈現(xiàn)出廣闊的研究、開發(fā)前景。 本課題研究通過PCR擴增獲得噬菌體FX174的溶菌基因E，應(yīng)用DNA定點突變技術(shù)糾正了E基因序列中存在的琥珀突變，構(gòu)建成功利用串聯(lián)的pR、pL雙啟動子表達溶菌基因E的高效溶菌載體pElys1。pElys1在大腸桿菌工程菌株XL-1

3、blue中具有極高的溶菌效率，溶菌動力學(xué)檢測表明整個溶菌過程只需90min即可完成，溶菌后的活菌數(shù)(cfu/ml)比溶菌前下降超過5個指數(shù)級，溶菌(滅活)效率高達99.9997％，比國外研究者構(gòu)建的pR或pL單啟動子溶菌載體在同株大腸桿菌中的溶菌滅活效率高一個指數(shù)級。 PCR擴增由cI857、pR—pL、E基因、終止子構(gòu)成的完整的溶菌基因表達盒LC，經(jīng)T—A克隆后亞克隆入氯霉素抗性的廣宿主質(zhì)粒pBBR1MCS，構(gòu)建成功廣宿主溶

4、菌載體pBBR1ys。將該溶菌載體通過電擊方式轉(zhuǎn)化入禽致病性大腸桿菌(APEC)野毒株RC-123中，溶菌動力學(xué)試驗證實該溶菌載體對RC-123的溶菌滅活效率達到了99.9916％，而且制備的RC-123菌蛻經(jīng)過凍干制備的菌蛻疫苗檢測不出活菌。動物免疫試驗結(jié)果表明該菌蛻疫苗(未加任何佐劑)對10倍LD50劑量同源野毒株攻毒的雛鴨的免疫保護率達到75％，高于傳統(tǒng)福爾馬林滅活苗的68.75％。 通過兩次T—A克隆和一次亞克隆，構(gòu)建了

5、兩端為LacZ基因序列、中間為溶菌基因表達盒LC的等位基因片段LacZ：LC。等位基因片段LacZ：LC通過電擊轉(zhuǎn)化入APEC RC-123感受態(tài)細胞后，等位基因片段LacZ：LC以LC兩端的LacZ基因序列作為同源臂，與RC-123基因組中的LacZ基因發(fā)生雙交換同源重組。PCR鑒定證實LC已插入RC-123基因組的LacZ基因中，構(gòu)建成功核基因組依賴的APEC菌蛻菌株RC-123(ALacZ：LC)。溶菌動力學(xué)檢測結(jié)果表明RC-12

6、3(△LacZ：LC)的溶菌滅活效率達到了99.9913％，與廣宿主溶菌載體pBBRlys在同株細菌中的溶菌滅活效率(99.9916％)基本相當(dāng)。 以高效溶菌載體pElys1為基礎(chǔ)，通過定點突變技術(shù)在E基因與其上游的RBS位點之間引入平末端酶切位點EcoR V，構(gòu)建成功前T載體pElysM。用該前T載體pElysM按常規(guī)的酶切后加T的方法即可制備高效溫控正篩選T載體pEz—T。pEz—T用于T—A克隆時，只需用特定的溫度(42℃

7、)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子即可篩選出陽性克隆。pEz—T的自連、轉(zhuǎn)化實驗證實，由于對該T載體PCR片段插入位點的創(chuàng)新設(shè)計，其在用于T—A克隆時不會像傳統(tǒng)藍白斑篩選T載體一樣因為T載體自連而產(chǎn)生假陽性克隆。在對長度分別為219、603和1430 bp的PCR片段進行的3個應(yīng)用性T—A克隆實驗中，菌落PCR鑒定和測序結(jié)果均證實這些PCR片段被高效、快捷地克隆入該T載體中，而且沒有假陽性克隆產(chǎn)生。本課題研發(fā)的高效溫控正篩選T載體pEz—T克服了現(xiàn)有藍白斑篩