優(yōu)化型十拷貝rolGLP-1在大腸桿菌中的高效表達及其應用研究.pdf

1、目前，全球糖尿病患者有近3億，隨著人們生活節(jié)奏和生活方式的變化，糖尿病正在逐漸蔓延且發(fā)病人群向年輕化發(fā)展，糖尿病已成為威脅人類健康的重要慢性流行疾病，目前市場急需標本兼治的糖尿病治療藥物。
　　促胰島素(Incretin)又稱胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，能通過胰島β細胞表面的特異受體顯著增強葡萄糖誘導的胰島素分泌，有效降低糖尿病患者血糖水平，促進胰島β細胞胰島素基因轉錄和分泌，

2、促進胰島β細胞再生，抑制胰島β細胞凋亡，改善和恢復胰島細胞功能;防止糖尿病各種并發(fā)癥，抑制胰升血糖素的分泌和糖尿病患者胃的排空，消除其饑餓感，降低血脂，預防冠心病;GLP-1的促胰島素作用依賴于葡萄糖的濃度，用其治療糖尿病不會發(fā)生低血糖，被認為是一種“治標治本”的糖尿病治療多肽，對2型糖尿病的預防和治療具有重要意義。
　　人體內胰高血糖素樣肽以有活性的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺形式存在，但是其N端第8位的丙

3、氨酸極易被二肽酶(DPPⅣ)切割變成無活性的短肽GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)，半衰期僅數(shù)分鐘，成為GLP-1進入實際應用的主要瓶頸。因此，開發(fā)更穩(wěn)定的GLP-1類似肽，延長其體內有效作用時間成為近年來的熱門課題。
　　本實驗室前期通過點突變天然GLP-1，克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶降解的重組口服長效GLP-Ⅰ類似肽(recombinant oval long-acting GLP-1，rolGLP-1)。動物實

4、驗證明，GLP-M蛋白(10 tandem repeated rolGLP-1)可顯著降低糖尿病大鼠血糖水平，改善了由于高血糖引起的異常體征，對2型糖尿病具有良好的治療效果。由于GLP-M中各拷貝rolGLP-1之間通過酶切連接，導致兩個相鄰rolGLP-1之間多出三個氨基酸（脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸），并且為了便于蛋白純化，GLP-M的C端設計了純化標簽(6×His)，于是在GLP-1的完整序列外添加了一些冗余氨基酸，雖然短期看不出冗

5、余氨基酸的副作用，但是不能保證長期使用的安全性，而且影響新藥審批。為此，我們委托北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biological Technology Co.，Ltd，Beijing)合成了十拷貝rolGLP-1全基因，利用分子克隆和定點突變技術構建表達優(yōu)化促胰島素(Optimized rolGLP-1， Opt-rolGLP-1）的大腸桿菌工程菌株，能保證各拷貝之間的無縫連接(無任何多余的氨基酸）。
　　大腸桿菌工

6、程菌株F,.coli BL21(DE3)/Opt-rolGLP-1經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE和Western Blotting結果證明實現(xiàn)了Opt-rolGLP-1在大腸桿菌的高效分泌表達，對其誘導表達條件進行優(yōu)化，結果表明Opt-rolGLP-1的最佳表達條件為IPTG終濃度為1mM，25℃下培養(yǎng)8h。誘導后菌體經(jīng)過超聲破碎，采用陰離子交換層析和凝膠過濾層析，成功純化出純度高達98％的Opt-rolGLP-1，滿足動物實驗要求

7、。
　　Opt-rolGLP-1中每個拷貝rolGL,P-1 C端的最后一個氨基酸恰好是精氨酸（胰蛋白酶識別位點），體外酶切實驗證明，Opt-rolGLP-1可被胰蛋白酶識別并切割成單拷貝rolGLP-1。
　　通過對C57BL/6J小鼠進行高脂高糖飲食合并腹腔注射小劑量(mg/kg)鏈脲佐菌素，兩次成功構造2型糖尿病小鼠模型，證明此造模方法成熟穩(wěn)定。糖尿病小鼠經(jīng)過灌胃Opt-rolGLP-1和單拷貝rolGLP-1或皮下注

8、射單拷貝rolGLP-1治療后，小鼠飲食飲水量有所下降，因高血糖導致的體重下降現(xiàn)象也被遏止，而且小鼠的糖化血紅蛋白、膽固醇、甘油三酯含量明顯下降，高胰島素血癥和口服糖耐量都得到有效改善。此外Opt-rolGLP-1和rolGLP-1能上調糖尿病小鼠肝臟GLUT2、INSR、GCK mRNA的表達水平，同時下調肝臟PGC-1αmRNA的表達量，這可能是Opt-rolGLP-1和rolGLP-1治療糖尿病的重要分子機制之一。
　　本研