大腸桿菌操縱子改造及其應(yīng)用初步研究.pdf

1、代謝工程中的核心之一是代謝途徑的調(diào)控。原核生物大多數(shù)基因以操縱子的形式存在，功能相關(guān)的基因及調(diào)控序列形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。操縱子是原核生物基因基因調(diào)控的最重要的機(jī)制。而啟動(dòng)子是DNA上RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，是轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，在基因的表達(dá)過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。啟動(dòng)子的與RNA聚合酶的結(jié)合強(qiáng)度以及其與各種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用直接影響下游基因的轉(zhuǎn)錄水平以及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。操縱子是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，而啟動(dòng)子是操縱子中的重要生物學(xué)元件，

2、本實(shí)驗(yàn)從操縱子結(jié)構(gòu)以及啟動(dòng)子在操縱子中的分布對基因表達(dá)的調(diào)控作用進(jìn)行了初步研究。
　　 在低拷貝質(zhì)粒pCL1920上，構(gòu)建了一個(gè)無啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白編碼基因(gfp)和β-半乳糖苷酶編碼基因(lacZ)組成的操縱子，操縱子5端有一個(gè)啟動(dòng)子克隆區(qū)域，便于快速克隆目的啟動(dòng)子。利用該操縱子，可以綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶作為信號(hào)分子監(jiān)測啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度，即其在轉(zhuǎn)錄水平對操縱子中下游基因的調(diào)控作用。為啟動(dòng)子改造提供了分子生物學(xué)工

3、具，并利用該系統(tǒng)成功克隆了大腸桿菌內(nèi)fie、katE、spc、rpoS、nlpD啟動(dòng)子以及代謝工程中常用的trc啟動(dòng)子的核心區(qū)域，同時(shí)表征了上述啟動(dòng)子在體內(nèi)的啟動(dòng)下游基因表達(dá)特性。根據(jù)綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平，F(xiàn)ic，katE啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度較弱，而spc、rpoS、nlpD啟動(dòng)子較強(qiáng)，其中trc啟動(dòng)子的核心區(qū)域的啟動(dòng)能力最強(qiáng)，上述不同強(qiáng)度的啟動(dòng)可適用于在代謝工程中外源基因不同的表達(dá)水平。另外，利用操縱子中兩個(gè)報(bào)告基因探索了

4、操縱子中多拷貝啟動(dòng)子以及基因間啟動(dòng)子對基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。通過化學(xué)合成五個(gè)重復(fù)拷貝的trc核心區(qū)啟動(dòng)子MTre并將MTrc克隆在上述操縱子中，其啟動(dòng)強(qiáng)度是單拷貝trc核心區(qū)啟動(dòng)子強(qiáng)度的3.47倍；通過整合PCR得到trc、spc啟動(dòng)子串聯(lián)的trc-spc啟動(dòng)子，并將trc-spc啟動(dòng)子克隆在上述操縱子中，其啟動(dòng)強(qiáng)度強(qiáng)于trc和spc分別單拷貝的啟動(dòng)強(qiáng)度。通過增加操縱子中的啟動(dòng)子拷貝數(shù)可以增加下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)錄必須序

5、列較編碼基因更小，因此，增加啟動(dòng)子的拷貝數(shù)可以以最小的代謝負(fù)擔(dān)增加基因的表達(dá)水平，為代謝工程中基因的精確調(diào)控的分子生物學(xué)元件研究提供分子生物學(xué)工具。
　　 將4-羥基丁酸代謝途徑中三個(gè)關(guān)鍵基因克隆在lac啟動(dòng)子下游，構(gòu)建一個(gè)非天然存在的由琥珀酸到4-羥基丁酸代謝途徑操縱子，利用產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌株QZllll和XLl Blue△sdhA以葡萄糖為發(fā)酵底物積累聚-3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸共聚物。探索該合成操縱子在大腸桿菌中