枯草桿菌rib操縱子結(jié)構(gòu)基因在ccpA位點的表達.pdf

1、核黃素是重要的精細化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，核黃素工業(yè)生產(chǎn)方法主要是采用重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵法。在解除了枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑的反饋抑制后，核黃素操縱子的表達水平是影響核黃素合成速率和最終產(chǎn)量的關(guān)鍵因素?？梢圆捎脴?gòu)建游離型和整合型的重組質(zhì)粒，實現(xiàn)核黃素操縱子的過量表達，但是，游離質(zhì)粒固有的不穩(wěn)定性，以及整合質(zhì)粒需要使用抗生素不斷選擇所帶來的環(huán)境安全問題，使這種技術(shù)方法存在缺陷。CcpA蛋白是枯草芽孢桿菌的

2、一種全局調(diào)控蛋白，介導(dǎo)細胞的碳分解代謝物阻遏。CcpA蛋白的缺失可以在一定程度上解除碳分解代謝物阻遏效應(yīng)，而有利于核黃素的合成。從功能上判斷，ccpA基因應(yīng)該是組成型表達，其啟動子應(yīng)屬于中強啟動子。利用ccpA基因的表達元件表達核黃素操縱子的結(jié)構(gòu)基因，既可以實現(xiàn)核黃素操縱子的過量表達，又可以缺陷CcpA蛋白，解除碳分解代謝物阻遏對核黃素合成的抑制，是一種構(gòu)建高產(chǎn)核黃素基因工程菌的簡便、多效的方法。 本文以產(chǎn)核黃素的重組菌B.s

3、ubtilis24為出發(fā)菌株，首先采用同源重組方法對其recA基因的缺陷進行了恢復(fù)，得到B.subtilis24 X1。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果顯示，B.subtilis24 X1的生長速率和最大生物量均高于B.subtilis24，核黃素合成能力提高了25％。 對ccpA基因表達元件進行的序列分析和比對顯示，其啟動子具有中強啟動子的特征，SD序列和終止子序列都與共同序列十分接近，屬于強表達元件。 采用重疊PCR方法，將ccpA