18025.枯草桿菌coba和nasf的重組表達(dá)及活性研究

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：丕墓絲簽字日期：汐7綽‘月歹日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)

2、位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)。學(xué)位論文作者簽名：疊蘭絲簽字日期：加，2，年6月甲日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通信地址：指導(dǎo)教師簽名：簽字日期：

3、電話：郵編：摘要尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(SadenosylLmethionine：Uroporphyrinogenmethyltransferase，SUMT)是西羅血紅素、維生素B12等卟吩烷類化合物分支合成的第一個(gè)酶，SUMT過表達(dá)可以促進(jìn)維生素B12的產(chǎn)量，大腸桿菌重組表達(dá)SUMT在紫外燈下能觀察到紅色熒光，紅色熒光物質(zhì)是SUMT催化過程的副產(chǎn)物，所以重組細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱可以反映SUMT胞內(nèi)催化活性。作為紅色熒光蛋白，可用于胞內(nèi)下游酶活

4、性的測(cè)定。細(xì)菌SUMT的編碼基因呈現(xiàn)遺傳多樣性，分別為cobA、cobAhemD和cysG，枯草桿菌(Bacillussubtilis)中同時(shí)有cobA和cobAhemD這兩種基因，枯草桿菌的cobAhemD基因命名為nasF。目前對(duì)枯草桿菌編碼SUMT的基因研究尚未報(bào)道，本文分別研究了CobA和NasF重組表達(dá)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度差異和胞內(nèi)催化活性，取得如下結(jié)果：1克隆了枯草桿菌cobA和nasF基因，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示nasF基因中有

5、cobA結(jié)構(gòu)域，也有hemD結(jié)構(gòu)域。2構(gòu)建了CobA和NasF的表達(dá)載體，含CobA和NasF的重組細(xì)胞在紫外燈下觀察到紅色熒光。3CobA和NasF重組表達(dá)細(xì)胞破碎上清液紫外可見光譜掃描顯示，在354姍處有主要吸收峰，378nln有次級(jí)吸收峰；熒光光譜掃描顯示，激發(fā)峰為357n／ll，發(fā)射峰為620nnl。4測(cè)定了CobA和NasF重組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，在特定培養(yǎng)條件下，NasF重組細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于CobA。5分析了不同濃度IPTG對(duì)重

6、組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：IPTG濃度為05mM時(shí)為最佳誘導(dǎo)濃度，低于05mM熒光強(qiáng)度較低，而高于05mM時(shí)熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)，且對(duì)細(xì)胞有毒害作用。6外源添加不同濃度甜菜堿，分析對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：外源添加甜菜堿對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度無(wú)明顯促進(jìn)作用。7NiNTR一步親和純化CobA和NasF，SDS—PAGE顯示一條主帶，亞基分子量分別為28kD和55kD。綜上所述，枯草桿菌CobA和NasF都有過甲基化酶性質(zhì)，NasF重組