18025.枯草桿菌coba和nasf的重組表達及活性研究

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：丕墓絲簽字日期：汐7綽‘月歹日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學有關保留、使用學

2、位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權安徽農(nóng)業(yè)大學可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文，向社會公眾提供信息服務。(保密的學位論文在解密后適用本授權書)。學位論文作者簽名：疊蘭絲簽字日期：加，2，年6月甲日學位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通信地址：指導教師簽名：簽字日期：

3、電話：郵編：摘要尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(SadenosylLmethionine：Uroporphyrinogenmethyltransferase，SUMT)是西羅血紅素、維生素B12等卟吩烷類化合物分支合成的第一個酶，SUMT過表達可以促進維生素B12的產(chǎn)量，大腸桿菌重組表達SUMT在紫外燈下能觀察到紅色熒光，紅色熒光物質(zhì)是SUMT催化過程的副產(chǎn)物，所以重組細胞的熒光強弱可以反映SUMT胞內(nèi)催化活性。作為紅色熒光蛋白，可用于胞內(nèi)下游酶活

4、性的測定。細菌SUMT的編碼基因呈現(xiàn)遺傳多樣性，分別為cobA、cobAhemD和cysG，枯草桿菌(Bacillussubtilis)中同時有cobA和cobAhemD這兩種基因，枯草桿菌的cobAhemD基因命名為nasF。目前對枯草桿菌編碼SUMT的基因研究尚未報道，本文分別研究了CobA和NasF重組表達細胞的熒光強度差異和胞內(nèi)催化活性，取得如下結果：1克隆了枯草桿菌cobA和nasF基因，氨基酸序列比對結果顯示nasF基因中有

5、cobA結構域，也有hemD結構域。2構建了CobA和NasF的表達載體，含CobA和NasF的重組細胞在紫外燈下觀察到紅色熒光。3CobA和NasF重組表達細胞破碎上清液紫外可見光譜掃描顯示，在354姍處有主要吸收峰，378nln有次級吸收峰；熒光光譜掃描顯示，激發(fā)峰為357n／ll，發(fā)射峰為620nnl。4測定了CobA和NasF重組細胞的熒光強度，在特定培養(yǎng)條件下，NasF重組細胞熒光強度高于CobA。5分析了不同濃度IPTG對重

6、組細胞熒光強度的影響。結果表明：IPTG濃度為05mM時為最佳誘導濃度，低于05mM熒光強度較低，而高于05mM時熒光強度不再增強，且對細胞有毒害作用。6外源添加不同濃度甜菜堿，分析對熒光強度的影響。結果表明：外源添加甜菜堿對細菌的生長和熒光強度無明顯促進作用。7NiNTR一步親和純化CobA和NasF，SDS—PAGE顯示一條主帶，亞基分子量分別為28kD和55kD。綜上所述，枯草桿菌CobA和NasF都有過甲基化酶性質(zhì)，NasF重組