枯草桿菌兩步法生產(chǎn)四甲基吡嗪的調(diào)控及機(jī)制的研究.pdf

1、四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP),又稱川芎嗪,是吡嗪環(huán)碳原子上均連接甲基的含氮雜環(huán)化合物。TTMP作為天然香料,具有烘烤、花生、榛子和可可香氣,可用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、飲料酒和卷煙等香精的調(diào)配;同時(shí),TTMP是中藥材川芎(Ligusticum wallichii)根莖的主要活性生物堿成分,具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用,廣泛應(yīng)用于臨床。
　　 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP的研

2、究起步較晚,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少,且發(fā)酵體系中前體乙偶姻與氨反應(yīng)生成TTMP的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。目前,鮮有大規(guī)模TTMP發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化應(yīng)用實(shí)例,其原因主要為T(mén)TMP產(chǎn)量較低、前體乙偶姻的有效轉(zhuǎn)化率不高(＜1％)、外源添加的乙偶姻存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象且乙偶姻和TTMP均對(duì)細(xì)胞具有毒性等。因此,開(kāi)發(fā)具有優(yōu)良特性的TTMP生產(chǎn)菌株、研究微生物利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乙偶姻以及乙偶姻和氨反應(yīng)生成TTMP的機(jī)制、并基于不同產(chǎn)生機(jī)制建立合適的TTMP生產(chǎn)工藝是提

3、高微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的有效手段,為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 本文以獲得高產(chǎn)TTMP菌株為目標(biāo),首先建立了一種內(nèi)源前體篩選策略,從醬香型高溫大曲中獲得一株高產(chǎn)TTMP的菌株Bacillus subtilis XZ1124;根據(jù)其在不同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析,建立相應(yīng)的發(fā)酵策略;對(duì)發(fā)酵體系中TTMP的生成機(jī)制進(jìn)行探索,并基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立有效的微生物發(fā)酵偶聯(lián)TTMP合成工藝;同時(shí),利用發(fā)酵結(jié)束廢棄的菌體作用生物催化劑,建立枯

4、草桿菌多步轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻的工藝及其偶聯(lián)化學(xué)合成生產(chǎn)TTMP的工藝,具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)基于前體乙偶姻和TTMP分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,建立了一種適合于風(fēng)味化合物TTMP篩選的內(nèi)源前體篩選策略;并應(yīng)用該策略,從醬香型高溫大曲中獲得一株TTMP產(chǎn)生菌XZ1124,該菌株能利用葡萄糖代謝產(chǎn)生大量前體乙偶姻,從而有效促進(jìn)了TTMP的合成;根據(jù)菌落、細(xì)胞形態(tài)特征和生理生化特性以及16S rDNA序列分析,將該菌株鑒定為枯草桿

5、菌(Bacillus subtilis);通過(guò)單因素優(yōu)化,確定了最優(yōu)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件:蔗糖100g/l、豆餅粉40g/l、酵母膏5g/l、磷酸氫二銨30g/l、初始pH7.5、裝液量50/250 ml、搖床轉(zhuǎn)速200 rpm、培養(yǎng)溫度37℃;在此條件下,B.subtilis XZ1124搖瓶培養(yǎng)120 h,TTMP產(chǎn)量達(dá)4.08g/l,前體乙偶姻積累量在培養(yǎng)66 h時(shí)達(dá)到峰值(22.3g/l),前體的有效利用率達(dá)23.7％,遠(yuǎn)高于

6、文獻(xiàn)報(bào)道值(1％)。
　　 (2)根據(jù)不同pH控制下發(fā)酵罐培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)分析,建立了適合于枯草桿菌TTMP發(fā)酵的兩階段pH控制策略,通過(guò)控制培養(yǎng)前期的發(fā)酵液為弱酸性,保證細(xì)胞的快速增殖和前體乙偶姻的大量積累,培養(yǎng)后期調(diào)節(jié)發(fā)酵液為中性,促進(jìn)枯草桿菌轉(zhuǎn)化乙偶姻生成TTMP(7.43g/l);根據(jù)枯草桿菌在7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)不同攪拌轉(zhuǎn)速下的動(dòng)力學(xué)分析,結(jié)合發(fā)酵體系中前體乙偶姻和氨的化學(xué)反應(yīng)特性,建立了多階段攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)溫度控制的發(fā)酵

7、策略:0～12 h,控制培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為700 rpm,12～48 h,控制培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500.rpm,48～120 h,控制培養(yǎng)溫度55℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm,該發(fā)酵策略可有效促進(jìn)前體乙偶姻的大量積累,發(fā)酵結(jié)束時(shí)TTMP的產(chǎn)量達(dá)7.12g/l,比恒溫(37℃)和恒定攪拌轉(zhuǎn)速(500 rpm)培養(yǎng)時(shí)分別提高了38.5％和25.1％;根據(jù)不同初始葡萄糖濃度下的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析,建立了葡萄糖補(bǔ)加策略:初始葡萄糖濃

8、度為80g/l、培養(yǎng)36 h補(bǔ)加50g/l葡萄糖,該補(bǔ)加策略有效提高了前體乙偶姻的積累量,發(fā)酵結(jié)束時(shí)前體乙偶姻的積累量達(dá)40.9g/l,與對(duì)照發(fā)酵相比提高了96.6％;TTMP濃度達(dá)6.54 g/l,比對(duì)照發(fā)酵提高了28.2％。
　　 (3)考察了不同銨鹽對(duì)枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)TTMP的影響,結(jié)果表明磷酸氫二銨(DAP)對(duì)TTMP合成的促進(jìn)作用最為顯著,且NH4+和PO43-同時(shí)存在時(shí)該促進(jìn)作用尤為突出;提高培養(yǎng)基中初始DAP的濃度(

9、或單獨(dú)提高NH4+和PO43-濃度)可有效促進(jìn)發(fā)酵體系中TTMP的生成,然而,高濃度的NH4+和PO43-離子不利于細(xì)胞的增殖、糖的消耗以及前體乙偶姻的積累;基于細(xì)胞增殖、前體乙偶姻積累和產(chǎn)物TTMP合成過(guò)程對(duì)DAP需求的差異,提出DAP補(bǔ)加策略,并應(yīng)用于枯草桿菌搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程,TTMP的最大生成速率分別提高了46.8％和76.8％,發(fā)酵結(jié)束時(shí)TTMP產(chǎn)量分別為9.10和7.34 g/l。
　　 (4)建立了酶促反應(yīng)模

10、型體系,該模型體系為含有一定濃度乙偶姻和30 g/l磷酸氫二銨的溶液(pH7.0),通過(guò)向該模型體系中加入胞內(nèi)粗酶液和胞外粗酶液檢測(cè)TTMP的變化;并進(jìn)一步應(yīng)用原位反應(yīng)體系驗(yàn)證TTMP生成過(guò)程中的酶促催化反應(yīng),將枯草桿菌全細(xì)胞作為催化劑,考察了胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)體系中乙偶姻和氨反應(yīng)生成TTMP的影響;結(jié)果表明,發(fā)酵體系中TTMP的合成過(guò)程不存在酶促催化反應(yīng);但枯草桿菌培養(yǎng)液中可能存在一種或多種小分子代謝物,該代謝物能夠促進(jìn)乙偶姻和氨化學(xué)反

11、應(yīng)合成TTMP。
　　 (5)考察了不同質(zhì)子供體對(duì)乙偶姻和氨反應(yīng)生成TTMP的影響,磷酸鹽在pH7.01時(shí)主要以磷酸二氫根和磷酸一氫根共軛對(duì)形式存在,能夠提供足量的質(zhì)子參與乙偶姻和氨反應(yīng)生成Schiff堿的過(guò)程,促進(jìn)了TTMP的合成:通過(guò)考察糖代謝途徑中有機(jī)酸對(duì)枯草桿菌發(fā)酵體系中TTMP生成的影響,發(fā)現(xiàn)乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸和檸檬酸均可促進(jìn)發(fā)酵體系中TTMP的生成;進(jìn)一步考察了乙偶姻和DAP濃度、pH、溫度和攪拌條件以及供氧

12、條件對(duì)枯草桿菌原位發(fā)酵體系中TTMP和YTTMP/HB的影響,確定了最優(yōu)的TTMP合成條件,將100g/l乙偶姻和200g/l DAP的原位發(fā)酵體系于90℃、200 rpm的水浴搖床中反應(yīng)8 h后,TTMP的產(chǎn)量達(dá)45.1 g/l;在此基礎(chǔ)上,建立了枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻偶聯(lián)TTMP化學(xué)合成的工藝:在前體乙偶姻的積累階段,采用pH5.5的脅迫環(huán)境促進(jìn)枯草桿菌的快速增殖和前體乙偶姻的大量積累;培養(yǎng)120 h后,控制反應(yīng)條件為T(mén)TMP合成最

13、優(yōu)條件,反應(yīng)結(jié)束時(shí)TTMP的濃度達(dá)16.8g/l,該結(jié)果驗(yàn)證了枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)前體乙偶姻偶聯(lián)TTMP化學(xué)合成工藝提高TTMP產(chǎn)量的有效性。
　　 (6)建立了枯草桿菌全細(xì)胞多步轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻的工藝,確定了最適的轉(zhuǎn)化條件:葡萄糖濃度140g/l,細(xì)胞濃度100g/l,以0.5 M的PBS緩沖(pH7.0)為反應(yīng)介質(zhì),裝液量為20/50 ml,紗布密封,于35℃、150 rpm搖床中反應(yīng)96 h;在上述條件下,枯草桿菌轉(zhuǎn)化體系