枯草桿菌生物素操縱元基因的整合與表達.pdf

1、生物素(vitaminH)是一種含硫維生素，是動物機體維持正常生理機能所必需的B族維生素之一，隨著生物素缺乏癥在多種養(yǎng)殖動物中的出現，人們已經對生物素的營養(yǎng)生理功能有了全新的認識，并使其成為最受重視的水溶性維生素之一。生物素在畜牧業(yè)、分子生物學、生物發(fā)酵及醫(yī)藥行業(yè)等領域應用廣泛。生物素不能直接從自然界獲得，而我國所用的生物素均從日本、美國等國家進口，且價格昂貴，因此，進行生物素合成的研究是非常必要的。目前，利用基因工程技術生產生物素是國

2、際上高技術競爭的又一熱點。 枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，細胞壁不含內毒素，能分泌大量蛋白到體外，為一些重要工業(yè)酶制劑的生產菌種。而影響克隆基因表達效率的因素有2個：第一是啟動子的強度；第二是基因的拷貝數，但由于其在枯草桿菌中存在分離復制的不穩(wěn)定及外源基因的克隆表達效率低的現象，將外源目的基因整合到染色體上復制表達是解決染色體外復制質粒在宿主中遺傳不穩(wěn)定現象的有效策略。因此本研究以枯草芽孢桿菌1A747菌株為研究材料，通過同源重

3、組，將強的啟動子pglv以及Cm基因整合到枯草桿菌染色體上，增加生物素操縱元基因的拷貝數，對其進行功能表達及檢測。 設計引物以PCR方式擴枯草桿菌生物素操縱元基因bioWAFDB，得到整合載體YG50，根據這五個基因同源于與枯草桿菌1A747，通過單交叉整合方式將質粒YG50滾環(huán)式全部帶入1A747染色體基因組，得到單交叉整合菌BI1。分別用五對引物，即intedia-1，intedia-2，bioW-bioB，bioB-bio

4、W，Spec-bioF，PCR擴增法鑒定整合菌BI1。 設計引物Con-up和Con-down，以T載體為模板，PCR擴增出Con片斷，從TA克隆的質粒BL46上用限制性內切酶KpnI和ApaI消化，與相同酶切消化回收的E3骨架連接，得到質粒BL57。設計引物Cm-up和Cm-down，以PDL為模板，PCR擴增出Cm基因，用限制性內切酶ApaI和BamHI消化TA克隆的質粒BL47，與相同酶切消化回收的BL57載體連接，得到質

5、粒BL59。同樣設計引物pglvW-up和pglvW-down，從實驗室已構建好的質粒QJ34上PCR擴增出啟動子pglv與bioW基因，TA克隆的質粒為BL48，用限制性內切酶BamHI和SacI消化，與相同方式酶切消化回收的E3骨架連接，得到質粒BL56。再用限制性內切酶KpnI和BamHI消化BL59，回收Con片斷和Cm基因，用相同的酶消化回收的BL56載體連接，得到最終的雙交叉載體BL60。 用限制性內切酶ScaI線性

6、化質粒BL60，由于Con片斷和bioW基因分別同源于單交叉整合菌BI1染色體上的同名基因，因此，它們之間的Cm基因和pglv啟動子通過雙交叉整合方式替換掉枯草桿菌BI1原來染色體上的Spec抗性基因和Pbio啟動子，得到整合菌BI2，通過PCR擴增方式初篩。從Cm5μg/ml逐漸提高Cm抗性濃度到80μg/ml，BI2可正常生長，通過Southernblotting可檢測到5～15個拷貝數。通過微生物法和高效液相色譜法測定了生物素的表