生物素前體物：庚二酸在重組枯草芽孢桿菌中的高效合成.pdf

1、生物素(vitamin H)是動(dòng)物機(jī)體維持正常生理機(jī)能所必需的B族維生素之一，在畜牧業(yè)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。我國所用的生物素大部分從美國、同本等國家進(jìn)口，價(jià)格昂貴。因此，有必要進(jìn)行生物素合成研究。由于化學(xué)法生產(chǎn)的高污染性，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物素成為國際上高技術(shù)競爭的又一熱點(diǎn)。而枯草芽孢桿菌作為一種優(yōu)秀的基因工程菌成為生產(chǎn)生物素的首選。 庚二酸是枯草芽孢桿菌生物素合成前體物之一，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中通常被添加到發(fā)酵液中來提高生

2、物素產(chǎn)量，但其高價(jià)格和添加帶來的環(huán)境污染問題限制了它的應(yīng)用，成為發(fā)酵生產(chǎn)生物素過程中一個(gè)亟待解決的問題。通過基因重組來提高枯草芽孢桿菌自身庚二酸的產(chǎn)量就成了解決這個(gè)難題的唯一出路。在庚二酸合成基因方面人們做了大量的研究，現(xiàn)一致認(rèn)為枯草芽孢桿菌生物素操縱子中的biol-orf2基因序列與庚二酸合成密切相關(guān)。而orf3這個(gè)功能未知基因與該序列同處在一個(gè)獨(dú)立的操縱元上，推測(cè)可能對(duì)庚二酸的合成起輔助作用。 影響克隆基因表達(dá)效率的因素有2

3、個(gè)：第一是啟動(dòng)子強(qiáng)度；第二是基因拷貝數(shù)，但由于克隆質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中存在復(fù)制不穩(wěn)定及表達(dá)外源基因效率低等現(xiàn)象，將外源目的基因整合到染色體上復(fù)制表達(dá)成為解決這些問題的有效策略。本研究以枯草芽孢桿菌PY79菌株為研究材料，將強(qiáng)麥芽糖啟動(dòng)子P<,glv>及氯霉素基因連接到bioI-orf2-orf3順反子上游，然后通過同源重組整合到枯草芽孢桿菌染色體上。通過增加整合序列的拷貝數(shù)，最終增加庚二酸合成量。 設(shè)計(jì)引物Cm-up/Cm-do

4、wn和Cobiol-up/Cobio2-down，分別以質(zhì)粒pGJ103和枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增氯霉素基因(～1.0 kbp)和bioI-orf2-orf3順反子序列(～2.8 kbp)，純化的PCR產(chǎn)物分別克隆入pGEM-T和pBluskm載體中產(chǎn)生質(zhì)粒pLHX1和pLHX2。然后將pLHX2中的EcoRI-XbaI限制性內(nèi)切酶片段(BioI-orf2-orf3，2.8kbp)與pGJ113中的ApaI-Ec

5、oRI片段(P<,glv>，300 bp)相連接并克隆入pGEM-T載體中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生pYG57。將pLHXl中氯霉素基因片段連入pE3載體中產(chǎn)生pUtX5。最后將pYG57中XbaI-Anal片段(P<,glv>-biol-orf2-orf3)插入pLHX5中產(chǎn)生整合載體pLHX8。 所有的連接產(chǎn)物都以電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增。由于pI.HX8中的biol-orf2-orf3序列與枯草芽孢桿菌。PY7

6、9基因組生物素操縱子序列同源，通過單交叉整合方式將pLHX8滾環(huán)式帶入PY79染色體，形成BpLHX8。PCR初篩，正確整合子通過高氯霉素抗性(50μg/ml)擴(kuò)增整合序列拷貝數(shù)，通過Southem blotting可檢測(cè)到4～5個(gè)拷貝。通過反相高效液相色譜法測(cè)定了發(fā)酵液體中庚二酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，將P,-bilI-orf2-orf3順反子序列整合到宿主菌染色體，通過氯霉素抗性提高整合序列拷貝數(shù)以及麥芽糖誘導(dǎo)表達(dá)，提高了庚