玉米GLTR和GSAT的大腸桿菌重組表達及活性研究.pdf

1、5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是高等植物四吡咯分子如血紅素和葉綠素合成的第一個調(diào)節(jié)位點。ALA的合成由谷氨酰-tRNA還原酶（glutamyl-tRNA reductase，GLTR）和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶 (glutamate-1-semialdehyde aminotransferase，GSAT)催化。ALA在細胞中被轉(zhuǎn)化成尿卟啉原III，它被尿卟啉原III甲基化酶轉(zhuǎn)化成熒光化合物，重組

2、大腸桿菌細胞的熒光和細胞內(nèi)ALA產(chǎn)量呈正相關(guān)。已報道，GSAT結(jié)合硫氧還蛋白，它在氧化還原信號傳導中起重要作用。玉米葉肉細胞和維管束鞘細胞這兩個蛋白的分布存在明顯差異，但其調(diào)節(jié)機制尚不清楚。目前,尚無這兩個酶的活性研究報道，本文初步研究了玉米GLTR（maize GLTR，mGLTR）、GSAT(maize GSAT，mGSAT)以及mGSAT突變體（mGSATM）在大腸桿菌的重組表達和純化,建立了利用大腸桿菌為宿主檢測重組表達這兩個酶

3、活性，以及抑制劑對mGSAT活性影響的新型技術(shù)體系。獲得以下主要結(jié)果：
　　 1．重組蛋白的表達和純化：RT-PCR擴增成熟mGLTR和mGSAT的編碼基因，分別插入表達載體p28SUMO，0.5mmol/L的IPTG，28℃誘導12h，表達的靶蛋白N端融合小泛素相關(guān)修飾蛋白(SUMO)標簽，Ni-NTA一步親和純化融合蛋白，SUMO水解酶ULP除去SUMO標簽，SDS-PAGE顯示純化的mGLTR和mGSAT各為一條主帶，亞基

4、分子量分別約50kD和43kD左右。
　　 2．重組mGLTR的胞內(nèi)活性測定：大腸桿菌共表達ULP和含有SUMO-mGLTR融合蛋白，SDS-PAGE顯示ULP在細胞內(nèi)能有效切割SUMO-mGLTR，胞內(nèi)ALA含量為2.74μM/OD600，而對照為1.60μM/OD600。共表達ULP、SUMO-mGLTR和尿卟啉原III甲基化酶，重組菌的紅色熒光蛋白在激發(fā)光357nm、發(fā)射光620nm處顯示的熒光值為6.69，而對照為5.2

5、6。表明重組mGLTR在大腸桿菌細胞中具有催化活性。
　　 3．重組mGSAT及其突變體的胞內(nèi)活性測定：大腸桿菌共表達ULP、大腸桿菌GLTR和含有SUMO標簽的mGSAT(或mGSATM)，SDS-PAGE顯示ULP在細胞內(nèi)能有效切割SUMO-mGSAT，胞內(nèi)ALA含量為6.02μM/OD600(或6.42μM/OD600)，而對照為1.39μM/OD600。共表達ULP、EcGLTR、含有SUMO標簽的mGSAT和尿卟啉原I

6、II甲基化酶，重組菌的紅色熒光蛋白在激發(fā)光357nm、發(fā)射光620nm處顯示的熒光值為7.35，而對照為4.93。表明重組mGSAT及其突變體在大腸桿菌細胞中具有催化活性。
　　 4．純化的mGSAT蛋白性質(zhì)檢測：將純化得到的mGSAT進行紫外可見光譜掃描，結(jié)果顯示有337nm和410nm兩個光吸收峰，表明mGSAT蛋白結(jié)合輔酶磷酸吡哆胺。純化的mGSAT結(jié)合固定化的重組玉米硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）突變體，并

7、能被還原劑巰基乙醇剝離，SDS-PAGE檢測到mGSAT條帶，表明mGSAT和Trx有相互作用。綜上所述，本文克隆了玉米成熟mGLTR和mGSAT的編碼基因，分析了它們在大腸桿菌中的表達性質(zhì)，親和純化獲得了重組蛋白，建立了重組mGLTR和mGSAT在大腸桿菌細胞內(nèi)催化活性的檢測方法，初步分析了體外mGSAT與Trx突變體的相互作用。由于人和哺乳動物中不含有這兩個酶，該系統(tǒng)在篩選基于靶向GLTR和/或GSAT的安全除草劑和殺菌劑，以及在大