高Lys蛋白基因和高M(jìn)et蛋白基因在枯草芽孢桿菌中的共表達(dá).pdf

1、賴氨酸與蛋氨酸均為畜禽的限制性必需氨基酸，其飼料含量直接影響到畜禽蛋白質(zhì)的合成。本研究旨在通過基因工程手段構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體（含高賴氨酸蛋白基因的表達(dá)載體和含高蛋氨酸蛋白基因的表達(dá)載體），使辣椒花藥中高賴氨酸蛋白基因（Cflr）和玉米胚乳中高蛋氨酸基因（zein）在枯草芽孢桿菌中共同表達(dá)，建立高賴氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因在微生物中共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，為將含有高賴氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因的益生菌應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

2、>　　 本實(shí)驗(yàn)從辣椒花藥中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，根據(jù)高賴氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pHT43的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增出目的基因片段，獲得長為720bp的Cflr的DNA片段，與預(yù)期的目的片段大小一致。將辣椒花藥高賴氨酸蛋白基因(Cflr)片段克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR鑒定出的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上報(bào)道Cflr的cDNA全序列基因(基因登錄

3、號(hào):EU367999)進(jìn)行同源性比較、分析，結(jié)果同源性為99％。
　　 本實(shí)驗(yàn)從新鮮的玉米胚乳中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，根據(jù)高蛋氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pHT43的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增出目的基因片段，獲得長為476bp的zein的DNA片段，與預(yù)期的目的片段大小一致。將玉米醇溶蛋白基因（zein）片段克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR鑒定出的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序

4、，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上報(bào)道zein的cDNA全序列基因(基因登錄號(hào)為:541922 dzs10)進(jìn)行同源性比較、分析，結(jié)果同源性為99％。
　　 將測(cè)序成功的PCR產(chǎn)物Cflr基因片段通過酶切位點(diǎn)連接到原核表達(dá)載體pHT43上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌原核表達(dá)質(zhì)粒pHT43/Cflr;再將測(cè)序成功的PCR產(chǎn)物zein基因片段通過酶切位點(diǎn)連接到原核表

5、達(dá)載體pHT43上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌原核表達(dá)質(zhì)粒pHT43/zein。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法首先將原核表達(dá)質(zhì)粒pHT43/Cflr轉(zhuǎn)入野生型枯草芽孢桿菌168中，然后再將原核表達(dá)質(zhì)粒pHT43/zein轉(zhuǎn)入含有質(zhì)粒pHT43/Cflr的枯草芽孢桿菌中。經(jīng)過菌液PCR和測(cè)序等篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建成含有高Lys蛋白基因和高M(jìn)et蛋白基因的枯草芽孢桿菌168重

6、組菌。
　　 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，分別在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)到Cflr和zein基因的表達(dá)情況。通過qRT-PCR方法證明Cflr和zein基因在枯草芽孢桿菌中有mRNA水平的表達(dá);通過SDS-PAGE方法可以證明Cflr和zein基因在枯草芽孢桿菌中有蛋白水平的表達(dá)，SDS-PAGE中出現(xiàn)兩條明顯的目的蛋白條帶，一條大小為24kD，另一條大小為16kD。經(jīng)HPLC檢測(cè)重組菌發(fā)酵菌液的賴氨酸含量比野生型菌株菌液提高了1