費(fèi)氏中華根瘤菌HN01硫代謝相關(guān)操縱子的初步研究.pdf

1、硫是所有生命體的重要組成元素之一，自然條件下主要以氧化態(tài)硫酸鹽形式存在；植物、微生物吸收、還原硫酸鹽將之同化為自身物質(zhì)；生物體內(nèi)的硫主要以還原態(tài)存在。 根瘤菌結(jié)瘤因子還原性末端的硫化修飾與其宿主特異性密切相關(guān)。費(fèi)氏中華根瘤菌是一類最先在中國(guó)分離的快生型根瘤菌，可使大豆及多種豆科植物結(jié)瘤、固氮。為構(gòu)建廣宿主高效固氮工程菌奠定基礎(chǔ)，本文著重研究費(fèi)氏中華根瘤菌HN01硫代謝相關(guān)基因的一些生物學(xué)功能。 本實(shí)驗(yàn)室前期工作以Tn5g

2、usA5隨機(jī)插入誘變HN01獲得一株硫代謝缺陷突變體GXHN100，此突變體的互補(bǔ)質(zhì)粒為pGXHN300，內(nèi)含8 kb外源片段。亞克隆和信息學(xué)分析顯示該片段含五個(gè)轉(zhuǎn)錄方向一致的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)：ORFa、ORFb、ORFc、ORFd、ORFe；ORFa和ORFe的上游區(qū)域分別是啟動(dòng)子Pa和Pe。以載體pK18mob定向突變ORFa、ORFb、ORFc、ORFd獲得相應(yīng)非極性突變體HMa4、HM

3、b2、HMc6和HMd3，發(fā)現(xiàn)ORFa、ORFc、ORFd與硫代謝相關(guān)，分別將它們命名為cysG、cysⅠ和cysⅡ。本文在此基礎(chǔ)上研究ORFa、ORFb、ORFc、ORFd、ORFe在HN01體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄關(guān)系及cysG、cysⅠ和cysⅡ怎樣參與硫/氮代謝和它們?cè)诮Y(jié)瘤、固氮中的作用。 以出發(fā)菌株及各基因突變體的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄PCR并分析PCR產(chǎn)物表明：cysG、ORFb、cysⅠ、cysⅡ和ORFe均有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說(shuō)明它們

4、是功能性基因；前4個(gè)基因組成—多順反子，證明它們構(gòu)成一操縱子，命名為HSMROα(HN01 sulfur metabolism relative operon)，而ORFe不與前4個(gè)基因組成—轉(zhuǎn)錄單元。 檢測(cè)HMa4、HMc6和HMd3的亞硫酸還原酶活性發(fā)現(xiàn)它們僅分別為出發(fā)菌株的1.68％、2.3％和1.1％，表明cysG、cysⅠ和cysⅡ經(jīng)亞硫酸還原酶活性與硫代謝關(guān)聯(lián)。 甲硫氨酸/氯化銨為硫/氮源條件下，HMa4、H

5、Mc6、HMd3的生長(zhǎng)趨勢(shì)與HN01的無(wú)顯著差別，說(shuō)明cysG、cysⅠ和cysⅡ與氨態(tài)氮代謝無(wú)關(guān)。硫源不變，亞硝酸鹽為氮源時(shí)，突變體HMc6和HMd3的生長(zhǎng)趨勢(shì)與HN01無(wú)顯著差別，它們的亞硝酸還原酶活性與出發(fā)菌株的相當(dāng)，證明cysⅠ和cysⅡ基因不參與硝態(tài)氮的代謝過(guò)程。HMa4在甲硫氨酸/氯化銨為硫/氮源的生長(zhǎng)條件下，比出發(fā)菌株延遲8-9小時(shí)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其亞硝酸還原酶活性在誘導(dǎo)1小時(shí)后僅為出發(fā)菌株的53.5％，說(shuō)明cysG和硝態(tài)氮

6、代謝相關(guān)。 在植株?duì)I養(yǎng)液的最初硫源為硫酸鹽時(shí)，接種大豆的植株實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HMa4、HMc6和HMd3的結(jié)瘤時(shí)間分別比出發(fā)菌株延遲1天、2天和1天，其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力分別下降了27.8％、22.2％和25.4％。當(dāng)植株?duì)I養(yǎng)液的最初硫源為甲硫氨酸時(shí)，HMa4、HMc6和HMd3的缺失功能得到恢復(fù)，說(shuō)明無(wú)機(jī)硫代謝缺陷影響HN01的結(jié)瘤效率和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。另外，在相同培養(yǎng)條件下HMa4、HMc6和HMd3的固氮酶活性與出發(fā)菌株無(wú)顯著差別，證明c