變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸利用操縱子的初步研究.pdf

1、2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是目前國(guó)際上規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)的有機(jī)酸之一，主要用作食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽合成的前體。本論文旨在從國(guó)內(nèi)2KGA生產(chǎn)的主要工業(yè)用菌——變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01中克隆調(diào)控發(fā)酵目的產(chǎn)物分解代謝的2-酮基葡萄糖酸利用操縱子即 kgu操縱子（2-ketogluconate utilization operon, k

2、gu operon），并明確其基因的組成和生物學(xué)信息，在此基礎(chǔ)上采用異源表達(dá)和基因敲除等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)基因的功能進(jìn)行初步驗(yàn)證，為從分子水平上研究2KGA的代謝機(jī)理奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為有效提高2KGA的發(fā)酵生產(chǎn)效率提供重要的理論指導(dǎo)。主要結(jié)論如下：
　?。?）采用 LA-PCR技術(shù)首次從變形假單胞菌中克隆了含有 kgu操縱子完整序列的基因片段，其核苷酸序列長(zhǎng)度為6130 bp，其中包括基因ptxS、kguE、kguK、kguT和kguD，

3、預(yù)測(cè)其分別編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白 PtxS、2-酮基葡萄糖酸異構(gòu)酶（KguE）、2-酮基葡萄糖酸激酶（KguK）、2-酮基葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KguT）和2-酮基葡萄糖酸還原酶（KguD）。對(duì)非編碼區(qū)核苷酸序列的分析結(jié)果表明，從變形假單胞菌JUIM01中克隆的基因片段中可能存在兩個(gè)操縱子，分別為ptxS操縱子和kgu操縱子，即變形假單胞菌JUIM01的kgu操縱子僅由kguE、kguK、kguT和kguD等4個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成。
　?。?）基

4、于變形假單胞菌 kgu操縱子的生物信息學(xué)分析結(jié)果，采用 TD-PCR技術(shù)克隆了kguE和kguD的完整序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了重組菌株E. coli BL21(DE3)/pET-28a-kguE和E. coli BL21(DE3)/pET-28a-kguD。SDS-PAGE及Western-Blot分析結(jié)果表明，目的基因kguE和kguD在E. coli BL21(DE3)中均得到了成功表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白的分子質(zhì)量分別約為29.0 k

5、u和36.0 ku，與采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的KguE和KguD的分子質(zhì)量相符。酶活測(cè)定結(jié)果表明，kguD編碼的KguD可能參與了2KGA的分解代謝。
　?。?）基于變形假單胞菌 kgu操縱子的生物信息學(xué)分析結(jié)果，分別采用 TD-PCR技術(shù)和overlap-PCR技術(shù)克隆了kguT基因的完整序列和kguT缺失片段，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因敲除菌株 Ps. plecoglossicida JUIM01△kguT和基因回補(bǔ)菌株 Ps. p

6、lecoglossicida JUIM01△kguT-pBBR1MCS-2-kguT。2KGA利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在2KGA鈣鹽作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上，基因敲除菌株不能生長(zhǎng)而基因回補(bǔ)菌株能夠生長(zhǎng)，說明kguT基因編碼的蛋白參與了2KGA的分解代謝。本實(shí)驗(yàn)獲得的基因敲除菌株 Ps. plecoglossicida JUIM01△kguT能夠有效阻斷2KGA的代謝途徑，在2KGA的發(fā)酵生產(chǎn)中具有一定的優(yōu)勢(shì)，有利于降低生產(chǎn)成本，有望應(yīng)用于2