熒光假單胞菌R4直接轉(zhuǎn)化大米淀粉水解糖合成2-酮基-D-葡萄糖酸的研究.pdf

1、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconicacid，2KGA)是一種重要的有機(jī)酸，它是合成D-異抗壞血酸及其鈉鹽的重要中間體。在工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉水解糖是生產(chǎn)2KGA的主要原料。大米淀粉水解糖中除了含有高濃度的葡萄糖（大于230g·L-1）外，還含有少量的游離態(tài)蛋白質(zhì)，可作為菌體生長的氮源。基于大米淀粉水解糖這一特性，本課題將2KGA發(fā)酵法與靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法結(jié)合在一起，建立一種新的2KGA生物轉(zhuǎn)化方法，以取代現(xiàn)行的發(fā)酵法，從

2、而達(dá)到節(jié)能降耗、提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本的目的。主要結(jié)論如下:
　　 (1)建立了HPLC法定量檢測2KGA的方法。2KGA的紫外最大吸收波長為194nm，選擇2KGA的檢測波長為216nm，保留時(shí)間為3.738min，線性回歸方程為Y=1.5818X-0.0354(R2＞0.9999)，線性范圍1.0g·L-1～20.0g·L-1;精密度的RSD為0.14％，穩(wěn)定性的RSD為2.15％，重現(xiàn)性的RSD為0.25％，2KGA平

3、均回收率為99.42％、RSD為0.16％。
　　 (2)對(duì)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的滅菌條件、熒光假單胞菌AR4種子培養(yǎng)過程以及菌體培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)酸性能的影響進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基在108℃、15min條件下滅菌，2KGA轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了90.72％;菌體細(xì)胞的種齡為18h。
　　 (3)對(duì)熒光假單胞菌AR4直接利用大米淀粉水解糖合成2KGA的條件進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，初始細(xì)胞濃度、轉(zhuǎn)化溫度、底物濃度、搖瓶

4、裝液量、轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基初始pH值對(duì)2KGA的合成均有顯著影響;2KGA合成的適宜條件為:初始細(xì)胞濃度2.0g·L-1、轉(zhuǎn)化溫度30℃、底物濃度180g·L-1、500mL三角瓶裝液量40mL、初始pH值7.0。在此條件下，2KGA平均產(chǎn)量、平均生產(chǎn)強(qiáng)度和平均轉(zhuǎn)化率分別為180.79g·L-1、2.83g·L-1·h-1和93.19％，分別比分批發(fā)酵法高出6.86g·L-1、0.11g·L-1·h-1和3.00％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，熒

5、光假單胞菌AR4菌體細(xì)胞具有較好的重復(fù)利用穩(wěn)定性和低溫保藏穩(wěn)定性。
　　 (4)熒光假單胞菌AR4直接利用大米淀粉水解糖合成2KGA的轉(zhuǎn)化過程大致可以分為兩個(gè)階段:第一階段，菌體快速生長，2KGA隨著葡萄糖的消耗逐漸積累;第二階段，氮源物質(zhì)消耗殆盡，菌體基本停止生長，菌體細(xì)胞濃度基本穩(wěn)定，菌體細(xì)胞繼續(xù)利用葡萄糖快速合成2KGA至葡萄糖消耗殆盡為止。
　　 (5)對(duì)2KGA生物轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，建立了動(dòng)力學(xué)模型。