熒光假單胞菌AR4膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶的分離純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、膜結(jié)合吡咯喹啉醌依賴的葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase，PQQ-GDH，EC1.1.5.2)是食品添加劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽的合成前體2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)生物合成過程中的關(guān)鍵酶。
　　本論文對國內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)用菌熒光假單胞菌AR4的膜結(jié)合PQQ-GDH進行了分離純化和鑒定，系統(tǒng)研究了PQQ-GDH的酶學(xué)性質(zhì)，并初步開展了酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究，

2、為2KGA高效生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)。
　　主要結(jié)論如下:
　　(1)經(jīng)過超聲破碎細胞、Triton X-114兩相分離、丙酮沉淀、聚乙二醇6000沉淀、乙醇沉淀以及Hydroxyapatite Fast Flow層析等6個步驟分離純化，獲得了比活為14.6 U/mg、純化倍數(shù)達76.7倍的熒光假單胞菌AR4的膜結(jié)合PQQ-GDH。
　　(2) SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，熒光假單胞菌AR4的膜結(jié)合PQ

3、Q-GDH是單體蛋白，只有一個亞基，相對分子質(zhì)量為90 kDa左右?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果證明，從熒光假單胞菌AR4分離純化的蛋白質(zhì)確實為膜結(jié)合的PQQ依賴的GDH，相對分子質(zhì)量87kDa左右。
　　(3)酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，熒光假單胞菌AR4的膜結(jié)合PQQ-GDH的最適反應(yīng)pH值為6.0，最適反應(yīng)溫度為35℃，在pH3.0～6.0、15～35℃具有較好的穩(wěn)定性，在含有20％甘油的磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)中

4、，熒光假單胞菌AR4膜結(jié)合PQQ-GDH的穩(wěn)定性較高;Mg2+對膜結(jié)合PQQ-GDH具有促進作用，Zn2+在10mmol/L對PQQ-GDH具有促進作用，但高于50mmol/L時具有很強的抑制作用;Cu2+、Fe3+、Mn2+、一些常用的有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮和正己烷）、等對該酶具有不同程度的抑制作用;EDTA對膜結(jié)合PQQ-GDH的影響具有明顯的抑制作用，說明該酶屬于金屬酶;膜結(jié)合PQQ-GDH具有廣泛的底物特異性，可以以D-葡萄

5、糖、D-麥芽糖、D-木糖和D-半乳糖為底物，但是不能以蔗糖、D-果糖和D-葡萄糖酸鈉作為底物，D-葡萄糖為最適底物;輔因子（輔基）PQQ與酶蛋白的結(jié)合是緊密的。
　　(4)以DCIP-PMS為電子受體，以D-葡萄糖為底物，25℃、pH6.0的條件下，熒光假單胞菌AR4膜結(jié)合PQQ-GDH的酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax為15.552μmol/mg·min，Km為0.040 mol/L;當(dāng)?shù)孜餅镈-木糖時，膜結(jié)合PQQ-GDH酶促反