一菌雙酶構(gòu)建乙醛還原酶與葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)體系及其初步應(yīng)用.pdf

1、PreliminaryStudyontheconstructionandapplicationofrecombinantcarryingaldehydereductasecouplingglucosedehydrogenaseDissertationSubmittedtoNanjingUniversityofTechnologyinpartialfulfillmentofrequirementforthedegreeofMasterof

2、ScienceByXUHaoSupervisor：ProfHEBing—fangProLB—December2008碩士學(xué)位論文摘要氧化還原酶在工業(yè)生物催化中起著非常重要的作用，大多數(shù)氧化還原酶在生物催化反應(yīng)過(guò)程中需要輔酶作為氫或電子的傳遞體，輔酶再生是實(shí)現(xiàn)氧化還原酶催化反應(yīng)的必需步驟。目前研究最廣泛的酶法再生體系是甲酸脫氫酶(FDH)體系和葡萄糖脫氫酶(GDH)體系。葡萄糖／葡萄糖脫氫酶具有很高的還原電勢(shì)，不僅適用于NADH再生，還可

3、再生更為昂貴的NADPH。但是應(yīng)用純酶再生體系成本過(guò)高，因此把酶法再生體系應(yīng)用到微生物細(xì)胞內(nèi)，也是輔酶再生領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。4氯一3一羥基丁酸乙酯(CHBE)是多種藥物的手性中間體，可由4氯乙酰乙酸乙酯(COBE)選擇性還原制備。赭色擲孢酵母中的乙醛還原酶(ARI)可以還原4氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為(R)CHBE，但是此不對(duì)稱還原反應(yīng)的過(guò)程需要還原型輔酶NADPH參與。高產(chǎn)量、高純度的(R)CHBE的獲得，需要高效的輔酶再生循

4、環(huán)體系。外源基因的共表達(dá)可以有效地節(jié)約生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量。氧化還原與輔酶再生的共表達(dá)體系，在進(jìn)行催化的同時(shí)也提供了內(nèi)源性的輔酶再生，是實(shí)現(xiàn)高效氧化還原反應(yīng)的重要技術(shù)手段。本研究先將乙醛還原酶在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。通過(guò)RTPCR從真核生物赭色擲孢酵母中克隆了乙醛還原酶cDNA序列，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pETair，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后乙醛還原酶比酶活達(dá)到4091U／mg，顯著高于原始菌株赭色擲孢酵母。然后將輔酶NADP

5、H再生關(guān)鍵酶GDH和ARI在同一大腸桿菌中偶聯(lián)表達(dá)。采用雙啟動(dòng)子構(gòu)建乙醛還原酶基因(口∽和葡萄糖脫氫酶基因(gab)的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組菌BL21／pETairT7gdh。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度參數(shù)的優(yōu)化，ARI酶活達(dá)到213U／mg，GDH酶活達(dá)到1906U／mg。SDS—PAGE電泳分析表明重組蛋白乙醛還原酶表達(dá)量約占全菌胞內(nèi)可溶性蛋白的13％，而葡萄糖脫氫酶表達(dá)量約占全細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的39％，實(shí)現(xiàn)