3-脫氧葡萄糖醛酮還原酶體外酶促反應(yīng)體系的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、本研究分為四部分： 一、3-脫氧葡萄糖醛酮還原酶的初步鑒定 目的：對(duì)從雞肝臟中提取的3-脫氧葡萄糖醛酮還原酶進(jìn)行初步鑒定。 方法：應(yīng)用3-脫氧葡萄糖醛酮（3-Deoxyglucosone，3-DG）為底物的體外酶促反應(yīng)體系，以輔酶NADPH的消耗反映提取得到的3-DG還原酶活性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定所提取酶蛋白的分子量；TLC法鑒定體外酶促反應(yīng)的還原產(chǎn)物。 結(jié)果：體外酶促反應(yīng)：反應(yīng)組剩余NADP

2、H的OD值（0.649±0.107，n=3）明顯低于空白對(duì)照組（0.795±0.002，n=3）（p<0.05），表明提取的3-DG還原酶具有一定的活性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：顯示兩條蛋白質(zhì)帶，分子量分別為49kDa和180kDa，與文獻(xiàn)比對(duì)，提示49kDa區(qū)帶為3-DG還原酶；TLC法：酶促反應(yīng)液中有兩個(gè)斑點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，提示為3-DG（Rf值約0.6）和3-脫氧果糖（3-Deoxyfructose，3-DF）（Rf值約0.5

3、2）。 結(jié)論：可從雞肝臟中提取得到含有活性的3-DG還原酶，其分子量約為49kDa，能催化其底物3-DG生成3-DF?？梢赃x取雞肝臟作為穩(wěn)定獲得3-DG還原酶的合適來(lái)源。 二、3-脫氧葡萄糖醛酮還原酶體外酶促反應(yīng)體系中底物3-脫氧葡萄糖醛酮含量測(cè)定方法的建立 目的：建立3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中底物3-DG的含量檢測(cè)方法，以底物3-DG的消耗來(lái)反映3-DG還原酶活性。 方法：應(yīng)用2，3-二氨基萘柱前

4、衍生，采用C18反相色譜柱（4.6*250mm，5μm）為固定相，5mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH7.4）-甲醇-乙腈（70：5：25）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為Ex/Em=271/503nm的高效液相色譜條件，測(cè)定3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中底物3-DG的剩余量；利用2，4-二硝基苯肼作為顯色劑，采用紫外分光光度法測(cè)定3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中底物3-DG的剩余量。 結(jié)果：采用RP-HPLC法，3-DG峰呈尖峰，分離較

5、好（理論塔板數(shù)為6459）：在1～5μg·mL-1濃度范圍內(nèi)成線性（Y=332.40x+34.50，r=0.9992）：精密度RSD：1.2％（n=5）；重現(xiàn)性RSD：6.3％（n=6）；24h內(nèi)的穩(wěn)定性考察，其RSD為3.5％。平均加樣回收率為77.17％，RSD為8.98％（n=5）。采用UV法：3-DG在5～70μg·mL-1范圍內(nèi)成線性（y=0.0098x-0.0005，r=0.9988）；精密度RSD：0.7％（n=6）；重現(xiàn)

6、性RSD：3.6％（n=6）；平均加樣回收率：109.93％，RSD：16.73％（n=6）；穩(wěn)定性的考察，其OD值在1h內(nèi)下降約50％。RP-HPLC法和UV法測(cè)定酶促反應(yīng)體系中底物3-DG的含量，兩種方法相關(guān)系數(shù)r=0.86887，具有顯著相關(guān)（p<0.001）。 結(jié)論：建立了HPLC和UV二種檢測(cè)3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中3-DG含量的方法，為以底物3-DG的消耗反映3-DG還原酶活性提供了基礎(chǔ)。 三、3-脫

7、氧葡萄糖醛酮還原酶體外酶促反應(yīng)體系最適條件、影響因素和評(píng)價(jià)范圍考察 目的：對(duì)初步建立的3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系，進(jìn)行各反應(yīng)條件的優(yōu)化，并考察相關(guān)因素對(duì)酶促反應(yīng)體系的影響。 方法：用建立的RP-HPLC法檢測(cè)酶促反應(yīng)體系的3-DG含量，以單位時(shí)間內(nèi)底物3-DG的消耗反映3-DG還原酶的活性，分別對(duì)反應(yīng)體系中的輔酶NADPH濃度、3-DG還原酶酶量、底物3-DG濃度以及反應(yīng)時(shí)間條件進(jìn)行優(yōu)化，并考察溫度、pH、3-DG氧

8、化酶、保存條件對(duì)3-DG還原酶活性的影響。 結(jié)果：輔酶NADPH濃度在0.15-0.25mg·mL-1之間，隨著輔酶NADPH濃度的增加，3-DG的消耗量逐漸增加；當(dāng)輔酶NADPH濃度達(dá)到0.25-0.30mg·mL-1之間，3-DG的消耗量較為平穩(wěn)，接近平臺(tái)。3-DG還原酶酶量在50-200μL時(shí)，3-DG消耗量與酶量的加入呈正比。當(dāng)酶量超過(guò)200μL時(shí)，3-DG消耗量趨于平穩(wěn)。底物3-DG濃度在50-400μg·mL-1下，

9、3-DG的消耗量和3-DG的濃度成正比；3-DG的消耗率隨之3-DG的濃度增加而降低。100μg·mL-1的3-DG濃度下，反應(yīng)時(shí)間在60-120min內(nèi)3-DG的消耗量較為穩(wěn)定。3-DG的消耗量隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。3-DG的消耗量在pH7.4-7.9之間時(shí)最高，且較為穩(wěn)定。3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中，用NAD代替NADPH時(shí)，從雞肝臟中提取的3-DG還原酶也能表達(dá)3-DG氧化酶活性，在提取純化3-DG還原酶后即時(shí)測(cè)定3-D

10、G還原酶活性，凍干酶粉的活性較液態(tài)條件下保存的酶活性較低。保存時(shí)間在30-180d內(nèi)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，3-DG消耗量降低。醛糖還原酶抑制劑（aldosereductaseinhibitor，ARI）依帕司他對(duì)3-DG還原酶有抑制作用，與反應(yīng)組相比有顯著性差異（p<0.001）；JZ01對(duì)3-DG還原酶活性有明顯的增高作用（p<0.01）；槲皮素能部分抑制3-DG還原酶活性（p<0.05），7002而對(duì)3-DG還原酶活性無(wú)調(diào)節(jié)作用。

11、 結(jié)論：以底物3-DG的消耗可以反映3-DG還原酶的活性。3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系最適宜條件為：100μL1mg·mL-13-DG溶液，100μL的2.5mg·mL-1NADPH，100μL的雞肝初步純化酶液混合，用50mmol·L-1PBS（pH7.4）緩沖溶液調(diào)反應(yīng)體系至1mL，混合物于37℃培養(yǎng)90min。3-DG還原酶活性容易受到溫度、pH變化的影響，反應(yīng)體系溫度在33-37℃范圍內(nèi)，pH在7.4-7.9時(shí)較為穩(wěn)定。

12、所提取的3-DG還原酶能表達(dá)3-DG氧化酶活性，對(duì)檢測(cè)基本沒(méi)有干擾。在-20℃條件下保存的3-DG還原酶酶液活性較高，隨著保存時(shí)間的增加，3-DG還原酶活性降低。優(yōu)化后的3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系，具有靈敏、穩(wěn)定、可靠的特征，有望成為篩選藥物的一種新方法。 四、3-脫氧葡萄糖醛酮還原酶體外酶促反應(yīng)體系（在防治糖尿病微血管并發(fā)癥中）的初步應(yīng)用 目的：應(yīng)用建立的3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系對(duì)已知臨床防治糖尿病并發(fā)癥常用

13、藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并進(jìn)行相關(guān)機(jī)理探討。 方法：將不同濃度的葡萄糖溶液（5.5、12.5、25、50、100mmol·L-1）、ARI代表藥依帕司他、羰基化合物清除劑代表藥氨基胍、中藥成分槲皮素分別加入到3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中，37℃孵育90min。用RP-HPLC法或UV法測(cè)定3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中的3-DG剩余量，以單位時(shí)間3-DG的消耗量來(lái)評(píng)價(jià)3-DG還原酶活性。 結(jié)果：與不加藥液的反應(yīng)組相比，5

14、0和100mmol·L-1葡萄糖溶液使3-DG還原酶活性下降，具有顯著性差異（p<0.05），5.5、12.5、25mmol·L-1葡萄糖對(duì)3-DG還原酶活性無(wú)增高作用（p>0.05）；ARI依帕司他對(duì)3-DG還原酶活性有完全抑制作用，與不加藥液的反應(yīng)組相比有顯著性差異（p<0.001）；氨基胍能增加3-DG還原酶體外酶促反應(yīng)體系中的3-DG的消耗量，與不加藥液的反應(yīng)組相比有顯著性差異（p<0.001）。中藥成分槲皮素對(duì)3-DG還原酶活

15、性有一定的抑制作用，與不加藥液反應(yīng)組相比有顯著性差異（p<0.001）。 結(jié)論：高糖對(duì)3-DG還原酶活性無(wú)促進(jìn)作用，在體外葡萄糖濃度達(dá)到50、100mmol·L-1時(shí)，可使3-DG還原酶活性下降。ARI依帕司他對(duì)3-DG還原酶活性完全抑制，提示依帕司他可能會(huì)引起機(jī)體3-DG代謝受阻，3-DG水平增高，而影響ARI防治糖尿病并發(fā)癥的臨床療效。氨基胍能化學(xué)結(jié)合3-DG，對(duì)3-DG還原酶活性無(wú)調(diào)節(jié)作用；中藥成分槲皮素對(duì)3-DG還原酶活