新月彎孢霉抗性菌株選育及P450酶特性分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究了新月彎孢霉細(xì)胞色素P450酶與甾體11β-羥基化的關(guān)系,選育具有酮康唑抗性標(biāo)記的氫化可的松高產(chǎn)菌株KA-91,并對(duì)其發(fā)酵條件工藝優(yōu)化.主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、通過CO差光譜法檢測到新月彎孢霉細(xì)胞中存在P450酶.苯巴比妥鈉和過氧化物酶增殖劑鄰苯二甲酸異辛酯以及RSA均對(duì)P450酶具有誘導(dǎo)作用.酮康唑?qū)450酶具有抑制作用.P450酶含量與氫化可的松的生成具有正相關(guān)性.2、確立了新月彎孢霉原生質(zhì)體的適宜形成與再生條件:將

2、培養(yǎng)22h的菌絲用0.3mol/L的二硫蘇糖醇處理20min,0.6mol/L的KCl作為滲穩(wěn)劑,30℃條件下經(jīng)0.5﹪新生酶234和1﹪?yán)w維素酶混合液(pH5.6)酶解3h,原生質(zhì)體釋放量達(dá)到7.76×10<'6>個(gè)/mL,再生率為23.07﹪.再生菌株菌落形態(tài)不變,保留了甾體11β-羥基化能力.3、采用NTG和紫外線復(fù)合誘變,結(jié)合酮康唑抗性篩選法,選育出氫化可的松高產(chǎn)菌株KA-91,氫化可的松轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.05﹪.將菌株KA-91

3、連續(xù)5次轉(zhuǎn)接斜面,發(fā)現(xiàn)菌株遺傳性能穩(wěn)定.4、確立了KA-91生產(chǎn)氫化可的松的適宜搖瓶分批發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖22g/L,牛肉膏5g/L,酵母膏4g/L;初始和轉(zhuǎn)化pH6.5;裝液量30mL/250mL三角瓶;搖瓶轉(zhuǎn)速0~6h:160 r/min;6~68h:200r/min;發(fā)酵溫度28℃;發(fā)酵周期72h.采用改進(jìn)工藝和最適投料方法,RSA投料濃度為1.0g/L時(shí),氫化可的松轉(zhuǎn)化率達(dá)到74.88﹪.以適宜搖瓶分批發(fā)酵條件為基礎(chǔ),