頭孢菌素C高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵特性研究.pdf

1、本論文以頭孢菌素C產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)理化誘變選育、復(fù)合誘變選育、推理選育及遞歸原生質(zhì)體融合（Genome shuffling）技術(shù)選育，篩選頭孢菌素C高產(chǎn)菌株，并進(jìn)行相關(guān)發(fā)酵特性的研究和發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，為頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)提供了菌株優(yōu)化改良的實(shí)驗(yàn)思路。
　　 首先，以頂頭孢霉ys-3為出發(fā)菌株通過(guò)紫外線、亞硝酸及其復(fù)合誘變技術(shù)進(jìn)行菌種的初步優(yōu)化選育，摸索合適的誘變劑量，確定最佳紫外誘變條件為30 W紫外燈下15

2、 cm處照射120 s，亞硝酸誘變條件為亞硝酸濃度50 mmol/L，誘變處理120 s時(shí)為最佳，多輪次誘變積累，共挑選出879株誘變子，通過(guò)瓊脂柱托盤抑菌高通量篩選，獲得了高產(chǎn)菌株FH-127，較出發(fā)菌株抑菌圈直徑提高了80％。
　　 然后，以誘變菌株FH-127為出發(fā)菌株，根據(jù)頭孢菌素C的生物合成途徑，選擇丙二酸、重金屬銅離子和頭孢菌素C鈉鹽作為篩選耐受壓力，確定丙二酸、銅離子、頭孢菌素C鈉鹽濃度分別為1％、0.06％、8

3、g/L時(shí)為臨界耐受濃度，分別收集得到銅離子耐受菌株269株，丙二酸耐受菌株187株，終產(chǎn)物耐受菌株273株，經(jīng)過(guò)瓊脂柱托盤抑菌實(shí)驗(yàn)初篩，搖瓶發(fā)酵HPLC復(fù)篩，獲得高產(chǎn)耐受菌株T-01069、TB-69068、TBC-68187、TBC-68071，為下一步Genome shuffling融合奠定基礎(chǔ)。
　　 采用Genome Shuffling技術(shù)，對(duì)原生質(zhì)體制備菌齡，酶解時(shí)間及高滲液的選擇進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳原生質(zhì)體制備條件和

4、再生方式，在30％ PEG 6000介導(dǎo)下對(duì)紫外和加熱雙親滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合10 min，PDA培養(yǎng)基雙層平板再生，并將所得的性狀優(yōu)良突變株進(jìn)行遞歸融合選育，瓊脂柱抑菌篩選并通過(guò)HPLC檢測(cè)，將選育出的多優(yōu)良性狀進(jìn)行整合，獲得高產(chǎn)融合子G4-13，且比原始菌株產(chǎn)量提高101.4％。
　　 在對(duì)最終篩選出的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)后，還研究了該菌株的發(fā)酵特性，首先分析了發(fā)酵過(guò)程中菌株對(duì)豆油的利用能力，降低了豆油添加量。隨后對(duì)豆油

5、進(jìn)行了硅膠柱層析，初步分為極性、中極性和弱極性組分，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)中弱極性的組分更有利于頭孢菌素的合成。接下來(lái)還進(jìn)行了發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)其進(jìn)行接種菌齡、發(fā)酵周期及發(fā)酵溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定最佳優(yōu)化條件為：接種膨大菌絲階段時(shí)期菌種，控制發(fā)酵溫度前期28 ℃，后期25 ℃，發(fā)酵136 h后，此條件HPLC檢測(cè)頭孢菌素C的含量最大。通過(guò)發(fā)酵特性優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終減短頂頭孢霉發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)頭孢菌素C發(fā)酵過(guò)程中的豆油添加量和動(dòng)力高耗問(wèn)題，為