櫛孔扇貝(Chlamys farreri)酚氧化酶的分離純化及特性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、前期研究發(fā)現(xiàn),細菌多糖刺激和病毒感染均可導(dǎo)致櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)血細胞中酚氧化酶活力急劇升高,表明酚氧化酶是櫛孔扇貝免疫應(yīng)答系統(tǒng)中最為敏感高效的因子之一(Xing et al.,2008;Lin et al.,2011)。本論文從櫛孔扇貝血細胞中分離純化出酚氧化酶,分析了該酶的生化及酶學(xué)特性;研究了酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物的抗菌活性;分析比較了櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝(Argopecten irradians)、菲律賓

2、蛤仔(Ruditapes philippinarum)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、毛蚶(Scapharca subcrenata)酚氧化酶在生化及酶學(xué)特性上的差異,為櫛孔扇貝酚氧化酶免疫機制的研究積累了數(shù)據(jù)。
   (1)櫛孔扇貝酚氧化酶的分離純化及生化和酶學(xué)特性研究。采用線性連續(xù)梯度非變性電泳(native-PAGE)結(jié)合凝膠過濾層析的方法從櫛孔扇貝血細胞中分離純化出酚氧化酶,研究了該酶的底物特

3、異性、動力學(xué)參數(shù)以及溫度、pH、二價金屬離子和抑制劑對酶活的影響。結(jié)果顯示:提純的酚氧化酶在native-PAGE中分子量為576kDa,SDS-PAGE中分子量為53kDa,表明該酶是由一種亞基組成的寡聚體;酚氧化酶對L-DOPA、鄰苯二酚、多巴胺和對苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為0.61mmol/L、0.20mmol/L、0.88mmol/L和0.83mmol/L,表明該酶是一種漆酶型的酚氧化酶,其對鄰苯二酚的親和力最高,對多巴胺的親和

4、力最低,對L-DOPA的親和力高于對苯二酚;酚氧化酶在30℃和pH8.0時具有最高酶活力;酚氧化酶活力受到Ca2+和Mg2+的強烈激活,但受到Fe2+的顯著抑制;酚氧化酶活力不受硫代尿素和疊氮鈉的影響,但受到抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、半胱氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DETC)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的強烈抑制,表明該酶是一種含銅的金屬酶。
   (2)櫛孔扇貝酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物的抗菌活性研究。通過觀察和測定提純的櫛孔

5、扇貝酚氧化酶與底物處理后的細菌生長情況,研究了櫛孔扇貝酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物對溶藻膠弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida、愛德華氏菌Edwardsiellatarda、停乳鏈球菌Streptococcus dysgadysgalactiae、海豚鏈球菌Streptococcus iniae和溶壁微球菌Micrococcu

6、s lysodeikticus的抗菌活性。細菌生長曲線測定結(jié)果顯示:酚氧化酶自身不能抑制細菌生長,酚氧化酶與L-DOPA或多巴胺的混合物可抑制細菌生長,表明是酚氧化酶的氧化產(chǎn)物而不是酚氧化酶具有抗菌活性;使用L-DOPA作底物時,酚氧化酶氧化產(chǎn)物僅對殺鮭氣單胞菌顯示出明顯的抑制作用,而使用多巴胺作為底物時,酚氧化酶氧化產(chǎn)物對革蘭氏陰性的溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和殺鮭氣單胞菌均表現(xiàn)出強烈的抑制作用,表明以多巴胺為底物獲得的酚氧化酶氧化產(chǎn)物比

7、以L-DOPA為底物獲得的氧化產(chǎn)物具有更強的細胞毒性;酚氧化酶的體外氧化產(chǎn)物對革蘭氏陽性的停乳鏈球菌、海豚鏈球菌和溶壁微球菌無抑制作用,表明與鏈球菌和微球菌相比,櫛孔扇貝酚氧化酶氧化產(chǎn)物對弧菌和氣單胞菌細胞成分的毒性作用更大;酚氧化酶氧化產(chǎn)物對同為革蘭氏陰性的愛德華氏菌無抑制作用,分析原因可能是愛德華氏菌分泌的胞外產(chǎn)物中含有一些具有抗氧化活力的多糖,這些多糖抑制了酚氧化酶的氧化反應(yīng)。顯微鏡檢測結(jié)果顯示:經(jīng)過與櫛孔扇貝酚氧化酶和多巴胺的共

8、孵育后,溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和殺鮭氣單胞菌的菌體透明度降低,多數(shù)菌體喪失了運動能力,細菌聚集成團,被黑色素所覆蓋。
   (3)櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑、毛蚶酚氧化酶的生化及酶學(xué)特性比較研究。采用線性連續(xù)梯度非變性電泳結(jié)合鄰苯二酚發(fā)色方法從海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑、毛蚶的血細胞中分離出酚氧化酶,分析比較了櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑、毛蚶酚氧化酶在底物特異性、動力學(xué)參數(shù)以及金屬

9、離子和抑制劑對酶活的影響上的差異。結(jié)果顯示:在檢測到的酚氧化酶種類上,櫛孔扇貝與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑相同,在血細胞中僅檢測到一種酚氧化酶,而從毛蚶的血細胞中則檢測出4種酚氧化酶;在分子量上,櫛孔扇貝酚氧化酶(576kDa)與海灣扇貝(555kDa)和菲律賓蛤仔(563kDa)中的酚氧化酶較為接近,而與皺紋盤鮑(228kDa)和毛蚶(391kDa、206kDa、174kDa、未知分子量,分別命名為S391PO、S206PO、S1

10、74PO和SuPO)中的酚氧化酶差異較大;在底物特異性上,櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑和毛蚶中的酚氧化酶相似,均可以氧化鄰二酚類底物和對二酚類底物,為漆酶型的酚氧化酶;在動力學(xué)參數(shù)上,櫛孔扇貝酚氧化酶對鄰苯二酚、L-DOPA、對苯二酚、多巴胺4種底物的Km值與海灣扇貝酚氧化酶比較接近,表明這兩種酶在催化能力上相近;在二價金屬離子對酶活的影響上,櫛孔扇貝與其他4種貝類的酚氧化酶的活力均對二價金屬離子極為敏感,都受到Fe

11、2+的顯著抑制,但Ca2+和Mg2+都介導(dǎo)的酚氧化酶活力增強現(xiàn)象只在櫛孔扇貝和海灣扇貝中存在,綜合比較得出,櫛孔扇貝酚氧化酶的二價金屬離子影響結(jié)果與海灣扇貝酚氧化酶較為接近,表明這兩種酚氧化酶在蛋白結(jié)構(gòu)上可能具有很高的相似性;在抑制劑對酶活的影響上,櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑和毛蚶中的酚氧化酶都受到EDTA和DETC的強烈抑制,均為含銅的金屬酶,但櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝酚氧化酶以及毛蚶中的S206PO和SuPO

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