櫛孔扇貝（Chlamys farreri）大規(guī)模死亡病原—AVND病毒單克隆抗體的制備及檢測技術(shù)研究.pdf

1、利用蔗糖密度梯度超速離心技術(shù)從自然發(fā)病的櫛孔扇貝組織分離高純度的AVND病毒粒子,并以此為抗原注射免疫Balb/c小鼠.將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠NS-1骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合.經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)和免疫熒光檢測技術(shù)(immunofluorescence assay,IFA)對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選.最后篩選出10株與AVND病毒發(fā)生反應(yīng)的陽性雜交瘤細(xì)胞株.其中,

2、有4株細(xì)胞(2B3,3C8,3G7和4C7)在連續(xù)培養(yǎng)中能穩(wěn)定傳代并對該病毒具有較強(qiáng)的特異性反應(yīng).這4株單克隆抗體的亞型分別為IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG2b.應(yīng)用膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)在超微水平上對這4株MAbs進(jìn)行的測定表明,它們對AVND病毒均具有高度的特異性,并且所識別的特異性位點均位于病毒粒子囊膜的纖突上.進(jìn)一步利用單克隆抗體建立了3種免疫學(xué)檢測技術(shù):間接ELISA、IFA和斑點免疫印跡(Dot-Immunoblo

3、t).其中,間接ELISA所能檢測病毒蛋白的最低量約為5ng;適合于AVND病毒現(xiàn)場快速檢測的Dot-immunoblot技術(shù)能適合于對稀釋100倍的病貝組織勻漿液進(jìn)行檢測.應(yīng)用間接ELISA檢測技術(shù)對不同養(yǎng)殖季節(jié)(2003年4-10月)的一齡貝進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),7月中旬至8月底病毒感染率和感染強(qiáng)度均處于當(dāng)年的最高峰,與流行病學(xué)調(diào)查中這一時期櫛孔扇貝所表現(xiàn)出的高死亡率完全吻合.作為對照,組織學(xué)檢測結(jié)果顯示,患病扇貝各主要器官(外套膜、鰓、胃

4、、腎等)的上皮組織可見顯著的上皮細(xì)胞腫脹、嗜堿性增強(qiáng)、排列紊亂、部分脫落以至完全壞死脫落等廣泛的組織病理學(xué)變化.進(jìn)一步利用IFA技術(shù)對患病扇貝進(jìn)行AVND病毒的原位檢測發(fā)現(xiàn),這種上皮組織的病理變化與病毒的感染之間具有一致的對應(yīng)關(guān)系,如僅陽性細(xì)胞(熒光染色的細(xì)胞)呈現(xiàn)明顯的病理改變;陽性細(xì)胞密度越高的部位,上皮細(xì)胞紊亂以及脫落的程度亦愈加嚴(yán)重.這一結(jié)果清楚地表明,AVND病毒的感染可以對櫛孔扇貝這一宿主造成極其嚴(yán)重的組織結(jié)構(gòu)上的病理性改變