南瓜屬植物總RNA的提取及抗氧化酶基因的擴(kuò)增.pdf

1、RNA提取是研究基因分離和表達(dá)的第一步，從含有多酚、多糖以及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取RNA存在很多問題，會造成RNA在提取過程中氧化、褐化、降解。為了建立一種經(jīng)濟(jì)快速的從南瓜屬植物中提取RNA的方法，本文嘗試了CTAB法、一步法、尿素/氯化鋰法、熱酚法、LUG法5種方法，對他們的結(jié)果進(jìn)行比較和改進(jìn)之后確定了一種適合南瓜和西葫蘆組織的RNA提取方法即改良CTAB法。該方法全程只需要2h，通過用等體積的異丙醇在-20℃處理20min來沉

2、淀RNA，用高濃度的NaCl(1.0-2.5M)和醋酸鈉來有效的去除多糖類化合物，利用該方法從西葫蘆和南瓜葉子以及果肉中成功的提取了總RNA。提出來的RNA很清楚的顯示出28s和18s兩條鏈，RNA的產(chǎn)量是210-250μg/g鮮重，A260/280是2.08-2.15，A260/230是2.0-2.12，提出來的RNA是沒有多酚、多糖、蛋白質(zhì)污染的高純度的RNA。
　　同時驗(yàn)證了RNA的保存方法，將RNA沉淀浸入無水乙醇中然后放

3、在-80℃冰箱中保存，靜置6個月后RNA質(zhì)量無變化。建立了一種簡并引物設(shè)計(jì)的方法:在NCBI中搜索出同一個屬中15種植物中同一種蛋白質(zhì)的序列，然后在NCBI中找出對應(yīng)的eDNA序列，利用CLCMain Workbench6，通過sequence alignment，結(jié)合引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)出了南瓜和西葫蘆組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶基因的簡并引物。
　　將南瓜和西葫蘆葉子和果肉中的Cu/Z