家蠶精氨酸激酶的功能初步研究.pdf

1、精氨酸激酶是一種廣泛存在于無脊椎生物并在能量代謝中發(fā)揮重要作用的磷酸原激酶。目前,人們已經(jīng)鑒定了多種生物的精氨酸激酶基因,但是針對家蠶精氨酸激酶基因相關的報道還比較少。
　　 本研究通過生物信息學與實驗相結(jié)合的方法克隆到了家蠶精氨酸激酶基因,并對它結(jié)構(gòu)和功能進行了初步研究。主要結(jié)論如下:
　　 (1)從Genbank中搜索到家蠶BmAK基因(GenBank登錄號:QD272299),并運用相關的生物信息學軟件對其進行了分

2、析,結(jié)果表明BmAK基因定位在家蠶第5號染色體上,其cDNA全長為1268 bp,含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子,5’和3’非翻譯區(qū)分別為30和170 bp,開放閱讀框(ORF)全長為1068 bp,編碼355個氨基酸,相對分子量為40 kDa,等電點為5.87。BmAK蛋白在進化上非常保守,通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)它與其他9個物種的AK序列相似度較高。
　　 (2)根據(jù)序列設計特異性引物,采用PCR技術擴增BrnAK全長基因,采用pE

3、T-28a(+)載體在大腸桿菌Rosetta中進行了融合表達,且得到了可溶性蛋白。利用Ni-TNA柱通過親和層析法純化出有活性的蛋白質(zhì),通過質(zhì)譜技術和Western blotting實驗進一步證實了質(zhì)粒pET28a(+)-BmAK在大腸桿菌Rosetta中表達的重組蛋白為His-BmAK融合蛋白。同時酶活力測定實驗證明該重組蛋白具有消耗ATP,即轉(zhuǎn)運高能磷酸基團的能力。通過細胞免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)該基因主要定位于細胞質(zhì)或細胞質(zhì)的某些組織上。

4、
　　 (3)RT-PCR結(jié)果顯示該基因在家蠶各組織和各發(fā)育階段都有表達,但在血淋巴、卵巢、精巢中的表達量較低,在脂肪體中的表達量較高；除在二齡和三齡家蠶中的表達量較低外,其余各發(fā)育階段都有表達,尤其在五齡的表達量最高。利用抗核型多角體病毒家蠶品系NB、敏感性品系306和用它們構(gòu)建的近等基因系BC8研究了AK在家蠶抗核型多角體病毒病中所發(fā)揮的作用。我們對這些家蠶品系添食病毒后24小時的中腸樣本進行了熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)AK基