對蝦精氨酸激酶與WSSV作用性質(zhì)初步研究.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevirus，WSSV)自1992年以來仍是世界范圍內(nèi)對蝦爆發(fā)性死亡的主要病原，對我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。目前在WSSV診斷檢測技術(shù)、病毒粒子的蛋白組成及其分子架構(gòu)、功能基因、對蝦免疫基因?qū)SSV感染的應(yīng)答等方面取得了一定進展?，F(xiàn)已鑒定得到一些WSSV蛋白與宿主細胞成分存在相互作用，可以明顯的延遲或中和WSSV的感染，另有一些對蝦蛋白，如PmRab7(Penaeusmonod

2、onRab7)、β-integrin（整合素）和F1-ATP合酶β亞基也參與了WSSV感染。為解析WSSV感染的分子機制，并探索通過阻斷其感染通路而達到生物防治的途徑，本研究主要集中在與WSSV相互作用的宿主成分，即受體蛋白。本實驗室前期通過對WSSV囊膜蛋白VP31和VP37的宿主受體蛋白的探究，洗脫下了對蝦鰓膜蛋白中的精氨酸激酶(AK)，證實精氨酸激酶與WSSV存在結(jié)合關(guān)系，可能是WSSV在宿主體內(nèi)的一個作用蛋白。從精氨酸激酶的重要

3、生理功能來說，它很可能在WSSV侵染宿主的過程扮演重要角色。國內(nèi)外對精氨酸激酶的研究目前多集中于進化、能量供給方面，將其作為病毒潛在受體進行研究還是首次。本實驗在此基礎(chǔ)上對精氨酸激酶做了如下研究:
　　 1.精氨酸激酶原核表達及抗體制備:根據(jù)已構(gòu)建的pET30a-AK和pET30a-VP31表達載體，通過原核表達技術(shù)對精氨酸激酶進行了表達，并制備了大量純化的蛋白。
　　 2.精氨酸激酶組織嗜性分析:為了更好的了解精氨酸激

4、酶與WSSV的作用，提取凡納濱對蝦的鰓、肌肉、淋巴器官、血細胞的RNA，以β-actin為內(nèi)參，對精氨酸激酶在各組織中的轉(zhuǎn)錄量進行檢測。檢測結(jié)果表明精氨酸激酶在凡納濱對蝦肌肉中的表達量十分豐富，而在血細胞中沒有檢測到精氨酸激酶。取中國對蝦各組織（血細胞、淋巴器官、胃、肝胰腺、鰓、肌肉、腸、上皮、眼、心臟）中精氨酸激酶的檢測。結(jié)果顯示在對蝦這10種組織種均有精氨酸激酶的表達。
　　 3.精氨酸激酶對WSSV感染的應(yīng)答效應(yīng):選健康的

5、凡納濱對蝦，采取肌肉注射的方式，進行WSSV人工感染，在感染后0，4，8，12，24，36，48，72h分別取鰓組織和肌肉組織，對精氨酸激酶的轉(zhuǎn)錄量進行了半定量監(jiān)測。結(jié)果表明WSSV的侵染對AK基因的表達量有影響，其表達量在4-8h內(nèi)呈上升趨勢，8h轉(zhuǎn)錄量突然升高，24h達到最值，36h表達量驟降，72h表達量再次升高。具體原因與功能聯(lián)系有待進一步的分析驗證。
　　 4.精氨酸激酶對WSSV囊膜蛋白VP31的體外磷酸化作用分析:

6、針對精氨酸激酶的特殊功能，以及能與VP31相互作用的關(guān)系，猜想精氨酸激酶可能對VP31具有磷酸化的作用，進而在WSSV入侵細胞時起到了提供能量的作用。通過體外磷酸化實驗并結(jié)合雙向電泳技術(shù)檢測，實驗結(jié)果顯示，與對照圖片相比，磷酸化處理過的rVP31有一個蛋白點明顯加強并且向等電點降低方向移動，顯示精氨酸激酶對VP31具有磷酸化作用。
　　 5.精氨酸激酶、VP31與WSSV的相互作用關(guān)系:采用細胞感染實驗，檢測rVP31、WSSV