兩株溶藻弧菌對對蝦抗WSSV感染作用差異的分子作用機制的研究.pdf

1、益生菌在水產(chǎn)界以得到了廣泛的應用和認可,也以逐步成為了對蝦控制病害的主要手段之一?，F(xiàn)階段，對于益生菌開發(fā)的種類已經(jīng)非常的豐富，但是益生菌的作用機制，還不是很清楚，多處于摸索階段。溶藻弧菌產(chǎn)益生菌以作為水被認可和應用，本實驗基于實驗室已有對溶藻弧菌投喂飼料對對蝦抗WSSV感染的研究結(jié)果差異為依據(jù)，不同溶藻弧菌菌株對對蝦抗WSSV的作用相差很大，本研究通過兩株菌株的差異比較，本研究通過分子生物學技術(shù)手段，尋找到菌株間存在的胞外、胞內(nèi)蛋白、多

2、糖之間的差異，進一步確定兩株菌株的胞外蛋白中的絲氨酸蛋白酶、胞外多糖等物質(zhì)存在明顯的差異。通過結(jié)果顯示，溶藻弧菌的胞外產(chǎn)物對對蝦抗病作用具有重要的價值。本研究為益生菌的篩選起到了一定的指示作用，并對益生菌的發(fā)酵和益生菌中的代謝產(chǎn)物中有價值的物質(zhì)的進一步利用提供了一定的參考價值。
　　本實驗共分為幾部分：利用16S技術(shù)、16-23S技術(shù)對菌種進行鑒定，利用SDS-PAGE,質(zhì)譜技術(shù)對菌體蛋白、外膜蛋白、胞外分泌蛋白及胞外多糖進行分離

3、及種類鑒定，對差異蛋白進行人工重組誘導純化，通過養(yǎng)殖侵染免疫實驗，免疫作用驗證蛋白的功能。
　　內(nèi)容和方法分為以下幾個方面：
　　1、通過16sDNA分子基因序列分析、結(jié)合16S-23RDNA分子手段將兩株溶藻弧菌鑒定到亞種。確定兩株分離自凡納濱對蝦腸道的兩株菌為溶藻弧菌不同株，其16-23SRNA之間存在差異對于細菌的鑒定還有很多技術(shù)手段。
　　2、利用16S-23rDNA分子手段及RFLP技術(shù)將多株溶藻弧菌鑒定進行

4、鑒定。將分離的多株溶藻弧菌的鑒定還有很多技術(shù)手段，利用 RFLP技術(shù)將16-23SrDNA不能分離的菌株得到了進一步的分離，該分子手段結(jié)合很好的將亞種進一步的得到了分離，為溶藻弧菌的菌株鑒定進行具有一定的作用。
　　3、通過 SDS-PAGE、質(zhì)譜分析等手段對溶藻弧菌進行蛋白的分離，找出差異蛋白，進一步通過質(zhì)譜分析鑒定出蛋白條帶差異帶為絲氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶為免疫中的重要物質(zhì)，具有天然的抗病毒作用，進一步推測溶藻弧菌中的胞外產(chǎn)

5、物中的絲氨酸蛋白酶具有抗病毒對蝦WSSV的作用，但由于其占胞外總蛋白含量較低，推測其絲氨酸蛋白酶的作用還需進一步驗證。
　　4、通過SDS-PAGE、質(zhì)譜分析等手段對溶藻弧菌全蛋白進行蛋白的分離，找出差異蛋白通過質(zhì)譜分析鑒定出蛋白條帶為鐵載體蛋白，通過人工重組鐵蛋白質(zhì)粒技術(shù)，將FER基因克隆并表達至載體pBAD/gIIIA中，構(gòu)成重組載pBAD/gIIIA-FER之質(zhì)粒。將重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10中進行原核表達，純化得到人

6、工重組鐵載體蛋白,在阿拉伯糖的誘導下，通過 Western-blot實驗結(jié)果顯示,得到預期的目標蛋白，證實重組表達蛋白實驗成功。
　　5、通過利用人工合成的重組細菌，在阿拉伯糖的誘導下，對于鐵蛋白的功能進行驗證，結(jié)果表明鐵蛋白本身只是有一定的提高免疫的作用，推遲對蝦的半數(shù)致死時間，最后免疫反應侵染實驗結(jié)果全部死亡，進一步說明細菌鐵載體本身主要是通過競爭鐵離子抑制其他細菌的繁殖，而該蛋白不能完全達到溶藻弧菌整體的作用效果，也進一步說

7、明益生菌應用的本身是通過整體的作用達到益生的效果。
　　6、通過利用細菌胞外多糖提取技術(shù)，得出兩株菌株之間的胞外多糖的產(chǎn)出率存在較大差異，雖然只有對于乳酸桿菌胞外多糖免疫作用的研究，本實驗結(jié)合前期的實驗基礎(chǔ)進一步證實溶藻弧菌代謝產(chǎn)物中的多糖物質(zhì)應該是這兩株溶藻弧菌產(chǎn)生對對蝦抗WSSV的作用差異的關(guān)鍵因素，為益生菌的有益產(chǎn)物的開發(fā)、利用具有重要作用，為益生菌對蝦抗WSSV的防治提供了理論基礎(chǔ)。
　　綜上所述，我們可以得出以下結(jié)