螺旋藻激酶抗凝和溶栓作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究螺旋藻激酶(Spirulina kinase，SPK)提取物和粗酶在體外及動(dòng)物體內(nèi)的抗凝和溶栓作用，并探討其可能的作用機(jī)制。為開發(fā)新型的抗凝和溶栓藥物打下良好基礎(chǔ)。 方法： 1.體外實(shí)驗(yàn)： (1) SPK粗酶的制備用生理鹽水浸泡SPK粉劑(經(jīng)廣西測(cè)試中心檢測(cè)活性為7000 IU/g)，攪拌1h后置于-4℃冰箱放置過夜，然后離心10 min棄去沉淀，上清液即為SPK提取液。采用硫酸銨分段鹽析法分離SPK提

2、取液，得到各段鹽析產(chǎn)物，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其活性，考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，溶栓活性與蛋白質(zhì)含量的比值為比活性。取比活性較高鹽析段低溫冷凍干燥后得到的產(chǎn)物即為SPK粗酶。 (2)SPK提取液的體外抗凝作用用試管法，三組試管分別加入高濃度SPK提取液、低濃度SPK提取液及生理鹽水各0.5 ml，再加入新鮮兔血1 ml，混勻后置于37℃水浴，同時(shí)啟動(dòng)秒表記錄血液凝固時(shí)間。 (3) SPK提取液的體外溶栓作用三組試

3、管均加新鮮兔血1 ml，血液靜止凝固后，棄掉血清，得到血凝塊，稱取重量。分別加入高濃度SPK提取液、低濃度SPK提取液及生理鹽水0.5 ml，并置于37℃恒溫水浴箱，觀察30 min后，稱取剩余血栓重量，分別計(jì)算各組溶栓率。 (4) SPK提取液體外對(duì)大鼠PT、APTT及TT的影響大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝得到血漿，并將血漿分成3份，每份0.2 ml，分別加入高濃度SPK提取液、低濃度SPK提取液及生理鹽水各0.2

4、ml，按試劑盒說明書操作，測(cè)定PT、APTT及TT值。并用纖維蛋白原溶液進(jìn)行糾正實(shí)驗(yàn)，探討其抗凝作用的機(jī)理。 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： (1)SPK粗酶對(duì)小鼠CT的影響小鼠隨機(jī)分為4組，SPK低濃度組、高濃度組、生理鹽水陰性對(duì)照組及肝素陽性對(duì)照組(12.5 IU/ml)，尾靜脈用藥，20 min后用毛細(xì)管法測(cè)定各組CT值。 (2) SPK粗酶溶液對(duì)大鼠PT、APTT、TT的影響大鼠隨機(jī)分為SPK低劑量組、SPK高劑量組、生

5、理鹽水陰性對(duì)照組及肝素陽性對(duì)照組(12.5 IU/ml)，股靜脈給藥，腹主動(dòng)脈取血，分離得到血漿，按試劑盒說明書操作，分別測(cè)定各組PT、APTT及TT值。 (3) SPK粗酶對(duì)大鼠靜脈血栓重量的影響大鼠隨機(jī)分為4組，即SPK低劑量組、高劑量組、生理鹽水陰性對(duì)照組及尿激酶陽性對(duì)照組(2000IU/ml)。大鼠麻醉后舌下靜脈給藥，先推半量，30 min后制備靜脈血栓模型，1h后再由舌下靜脈注入另外半量。30 min后重新開腹，取出血

6、栓并稱重，置于70℃干燥箱中1h后，待其冷卻后稱取干重，分別計(jì)算血栓濕重和干重抑制率。(4) SPK粗酶對(duì)大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路血栓重量及血漿D二聚體及t-PA含量的影響大鼠隨機(jī)分為4組，即SPK粗酶低劑量組、高劑量組、生理鹽水陰性對(duì)照組及尿激酶陽性對(duì)照組(2000 IU/ml)。大鼠麻醉后股靜脈給藥，制作動(dòng)靜脈環(huán)路血栓模型，取出血栓稱重，即得血栓濕重。在70℃干燥箱中1h后，待其冷卻后稱取干重，并求出血栓濕重、干重抑制率。腹主動(dòng)脈取血，制備枸

7、櫞酸鈉抗凝的血漿，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)部檢測(cè)D-二聚體含量，ELISA法檢測(cè)t-PA含量，并比較組間差異。 結(jié)果： 1.體外實(shí)驗(yàn) (1) SPK粗酶的制備硫酸銨分段鹽析法分離SPK提取液，45％～75％飽和度獲得的沉淀比活性最高，三蒸水充分透析后低溫冷凍干燥獲得SPK粗酶。 (2) SPK提取液的體外抗凝作用與生理鹽水組比較，高、低劑量SPK提取液均可顯著延長(zhǎng)家兔血液凝固時(shí)間(P<0.01

8、). (3)SPK提取液的體外溶栓作用與生理鹽水組比較，高、低劑量SPK提取液均可使血栓重量明顯減輕(P<0.01). (4) SPK提取液體外對(duì)PT、APTT及TT的影響：與生理鹽水組比較，高劑量SPK提取液在體外可使大鼠血漿的PT、APTT顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，高、低劑量SPK提取液可使大鼠血漿的TT顯著延長(zhǎng)(低劑量P<0.05，高劑量P<0.01)。 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) (1) SPK粗酶對(duì)小鼠CT的

9、影響與生理鹽水組比較，高劑量SPK粗酶可以延長(zhǎng)小鼠的CT(P<0.01)。 (2) SPK粗酶溶液對(duì)大鼠PT、APTT、TT的影響與生理鹽水組比較，SPK粗酶可使大鼠血漿的PT、APTT及TT顯著延長(zhǎng)(低劑量P<0.05，高劑量P<0.01)。 (3) SPK粗酶溶液對(duì)大鼠靜脈血栓重量的影響與生理鹽水組比較，高、低劑量SPK粗酶均使靜脈血栓的濕重、干重明顯減輕(P<0.01)。 (4) SPK粗酶對(duì)大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路

10、血栓重量及血漿D-二聚體和t-PA含量的影響制備動(dòng)靜脈環(huán)路血栓模型后，與生理鹽水組比較，高、低劑量SPK粗酶使大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路血栓的濕重、干重明顯減輕(P均<0.05)，高、低劑量組血漿D-二聚體含量明顯升高(P均<0.05)，高劑量組t-PA含量明顯升高(P<0.05)。 結(jié)論：硫酸銨分段鹽析法分離SPK提取物，45％～75％飽和度獲得的SPK粗酶比活性最高。SPK提取液在體外有明顯的抗凝血和直接溶解血凝塊的作用。SPK粗酶在體