螺旋藻激酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、目的：研究螺旋藻激酶的分離純化方法，為工業(yè)化放大生產(chǎn)螺旋藻激酶藥物提供一定的實驗依據(jù)，為后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究打下基礎(chǔ)。研究螺旋藻激酶的酶學(xué)性質(zhì)，為螺旋藻激酶的保存、運輸?shù)葪l件和開發(fā)成溶栓藥物提供一定的參考依據(jù)。
　　 方法：1.螺旋藻激酶的分離純化：(1)確定以纖維蛋白平板法作為檢測螺旋藻激酶活力的方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)確定以考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的方法，分別做靈敏度為100μg/mL和10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)螺旋

2、藻激酶粗酶液制備蒸餾水浸泡螺旋藻激酶發(fā)酵提取物粉劑，攪拌均勻后4℃下靜置過夜，棄去沉淀，上清液即為螺旋藻激酶粗酶液。(4)硫酸銨分級鹽析設(shè)定6個餾分，鹽析后分別收集上清液和沉淀，檢測酶活力，根據(jù)相對活力與硫酸銨飽和度繪制鹽析曲線。(5)透析處理透析袋，鹽析產(chǎn)物裝袋后置于蒸餾水中浸泡，隔1、2、4h換水，最后透析過夜。(6)凝膠過濾層析裝Sephadex G-75凝膠層析柱，將透析所得螺旋藻激酶液上柱，以PBS緩沖液洗脫，以紫外280nm

3、檢測同步檢測洗脫液，收集各穿透峰，并用纖維蛋白平板法檢測有無活力，收集有活力的穿透峰。(7)SDS-PAGE電泳安裝垂直電泳槽，制備凝膠，以SDS-PAGE電泳法驗證螺旋藻激酶純度，測定分子量。
　　 2.螺旋藻激酶的酶學(xué)性質(zhì)研究：(1)螺旋藻激酶的最適溫度將螺旋藻激酶點入纖維蛋白平板的小孔中，將纖維蛋白平板置于不同的溫度中保溫，測溶圈大小，以最高酶活力為100％，計算各溫度點螺旋藻激酶的相對活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱

4、坐標(biāo)，得出螺旋藻激酶反應(yīng)的最適溫度。
　　 (2)螺旋藻激酶的溫度穩(wěn)定性取6管螺旋藻激酶溶液，置于不同的溫度下保溫，每隔30min取樣，取出的酶液立即置于-20℃下冷凍保存，最后將所有樣品同時在一個纖維蛋白平板上測定活力，以最高酶活力作為100％，求相對活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)，得出螺旋藻激酶的溫度穩(wěn)定性結(jié)果。(3)螺旋藻激酶的最適pH配制一系列的pH濃度范圍為pH4～pH12的緩沖液，將纖維蛋白平板切割成小塊，

5、浸泡其中過夜以使膠塊內(nèi)液體與緩沖液充分交換，以測得37℃下螺旋藻激酶的最高活力為100％，求相對活力，以pH為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，找出螺旋藻激酶反應(yīng)的最適溫度。(4)螺旋藻激酶的pH穩(wěn)定性配制一系列pH濃度范圍為pH4～pH12的緩沖液，將螺旋藻激酶分別采用上述不同pH值的緩沖液溶解，以測得37℃下螺旋藻激酶的最高活力為100％，求相對活力，以pH為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得出螺旋藻激酶的pH穩(wěn)定性結(jié)果。(5)螺旋藻

6、激酶的作用方式取一塊纖維蛋白平板，切取一半出來于85℃下保溫30min，另一半不做處理。在兩塊平板上皆點樣螺旋藻激酶和尿激酶，同時放入37℃培養(yǎng)箱中保溫，觀察效果。(6)抑制劑和變性劑對酶活力的影響按一定比例分別配制螺旋藻激酶和抑制劑和變性劑的混合液，以蒸餾水和螺旋藻激酶的混合液為對照，37℃下保溫1 h測活力。
　　 結(jié)果：1.螺旋藻激酶的分離純化：(1)螺旋藻激酶粗分離制備螺旋藻激酶粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級鹽析，通過繪制鹽析曲線

7、，確定采用45％飽和度硫酸銨沉淀除去雜蛋白，再用75％飽和度硫酸銨沉淀收集該酶，經(jīng)透析后冷凍干燥保存。(2)凝膠過濾層析洗脫分離出洗脫峰，以纖維蛋白平板法檢測各洗脫峰活力，其中只有第2個洗脫峰有活力，其余洗脫峰均檢測不到酶活力，收集此峰洗脫液。(3)SDS-PAGE結(jié)果雜蛋白基本被除盡，得到單一的螺旋藻激酶蛋白帶，所得螺旋藻激酶的分子量為40 KD。
　　 2.螺旋藻激酶的酶學(xué)性質(zhì)研究：(1)螺旋藻激酶的最適溫度螺旋藻激酶在45

8、℃時活力最高，為其最適溫度，45℃～55℃是其最適反應(yīng)溫度范圍。(2)螺旋藻激酶的溫度穩(wěn)定性在50℃以下時，螺旋藻激酶的半衰期都在1 h以上，熱穩(wěn)定性強。(3)螺旋藻激酶的最適pH螺旋藻激酶最適反應(yīng)pH為8，最適pH值范圍為pH8～pH9。(4)螺旋藻激酶的pH穩(wěn)定性螺旋藻激酶在pH6～pH10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強，pH9的時候酶活力最高，低于pH6或超過pH10，穩(wěn)定性較差，說明螺旋藻激酶應(yīng)在偏堿的環(huán)境下保存。(5)螺旋藻激酶的作用方式

9、螺旋藻激酶溶解纖維蛋白的作用方式與尿激酶不同，螺旋藻激酶具有直接降解纖維蛋白的作用。(6)抑制劑和變性劑對酶活力的影響證明螺旋藻激酶是一種絲氨酸蛋白酶，結(jié)構(gòu)中不含二硫鍵。
　　 結(jié)論：螺旋藻激酶樣品經(jīng)過兩級硫酸銨鹽析和Sephadex G-75凝膠層析后，酶回收率達到42.3％，純化倍數(shù)達到6.1。螺旋藻激酶的最適溫度為45℃，低于50℃時有較好穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH為8，應(yīng)在偏堿環(huán)境下保存。螺旋藻激酶具有直接降解纖維蛋白的作用，