兩株弧菌的分子鑒定【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p><b>　　兩株弧菌的分子鑒定</b></p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目

3、錄</b></p><p>　　摘要（Abstract）</p><p>　　1 引言……………………………………………………………………………………………………………..1</p><p>　　1.1弧菌分類學(xué)現(xiàn)狀與分類學(xué)歷史 ……………………………………………………………………….. 1</p><p>　　1.1.1弧菌分類

4、學(xué)現(xiàn)狀…………………………………………………………………….. ……………..1</p><p>　　1.1.2 弧菌分類學(xué)歷史…………………………………………………………………………………... 1</p><p>　　1.2 16S rRNA簡介與應(yīng)用……………………………………………………………………………………1</p><p>　　1.3 研究的意義與內(nèi)容

5、………………………………………………………………………………………2</p><p>　　2 材料與方法……………………………………………………………………………………………………..2</p><p>　　2.1 實驗材料、儀器和試劑………………………………………………………………….... ……………..2</p><p>　　2.1.1 材料………………………

6、…………………………………………………………………………..2</p><p>　　2.1.2 儀器與設(shè)備…………………………………………………………………………………………2</p><p>　　2.1.3 試劑………………………………………………………………………………………………... 3</p><p>　　2.2 方法與步驟…………………………………………

7、……………………………………… ……………..3</p><p>　　2.2.1 實驗材料準(zhǔn)備及形態(tài)學(xué)觀察………………………………………………………..........................3</p><p>　　2.2.2 改良弧菌DNA提取方法……………………………………………………………………………...3</p><p>　　2.2.3 DNA測定

8、………………………………………………………………………………………………4</p><p>　　2.2.4 PCR擴增與測序……………………………………………………………………………………. 4</p><p>　　2.2.5 生物信息學(xué)分析……………………………………………………………………………………...5</p><p>　　3 結(jié)果與分析………………………

9、……………………………………………………………..........................5</p><p>　　3.1 兩株弧菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察…………………………………………………………………………...5</p><p>　　3.2兩株弧菌的DNA提取及其測定…………………………………………………….. …………………..6</p><p>　　3.

10、3 16S rRNA基因的PCR擴增與測序…………………………………………………………………………7</p><p>　　3.4 16S rRNA基因序列分析………………………………………………………………...............................8</p><p>　　3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析…………………………………………………………………………............

11、...................8</p><p>　　4.討論……………………………………………………………………………………………. ……………….9</p><p>　　4.1形態(tài)學(xué)觀察…………………………………………………………………………………………………9</p><p>　　4.2 改良弧菌DNA提取方法………………………………………………………

12、………………………..10</p><p>　　4.3 弧菌分子鑒定結(jié)果……………………………………………………………………….........................10</p><p>　　5結(jié)論……………………………………………………………………………………………. ……………...10</p><p>　　參考文獻………………………………………………

13、…………………………………………………………12</p><p>　　附錄………………………………………………………………………………………………………………13</p><p>　　附錄一：XHS2-9號菌株的16S rRNA基因測序結(jié)果………………………………………………………13</p><p>　　附錄二：461號菌株的16S rRNA基因測序結(jié)果……………

14、……………………………………………….13</p><p>　　摘要：本文選用的環(huán)境樣品為朱家尖淺水區(qū)水樣，利用TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)梯度稀釋平板法分離純化出相應(yīng)的兩株未知優(yōu)勢弧菌。本文建立了一種基于CTAB-NaCl法的改良弧菌DNA提取的方法，該法通過高鹽和CTAB對黏性多糖的沉淀而除去多糖，從而從富含黏性多糖的弧菌中提取獲得了高質(zhì)量的DNA。以16S rRNA基因作為分子標(biāo)記對環(huán)境樣品中分離的兩株未知弧菌樣品進

15、行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析從而對其分類學(xué)地位進行鑒定，鑒定結(jié)果為461號菌株為弧菌屬（Vibrio）的溶藻弧菌(V．a(chǎn)lginolyticus)，而XHS2-9號菌株為弧菌屬（Vibrio）的哈維氏弧菌(V．harveyi)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：弧菌；16S rRNA； 分子鑒定；系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析</p><p>　　Abstract: This essay selected for env

16、ironmental samples from zhujiajian phytal zone and utilized the TCBS culture medium to culture, separate and purify the corresponding dominate vibrios by the method of serial dilution of water samples. After the acquisit

17、ion of the corresponding two strains of vibiros,We established a improved DNA extraction method based on the CTAB –Nacl of the vibrios.And this method utilized the high-salt and CTAB to remove the polysaccharide by preci

18、pitating the viscous po</p><p>　　Keywords: vibrios；16S rRNA；molecular identification；phylogenetic analyses</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　1.1 弧菌分類學(xué)現(xiàn)狀與分類學(xué)歷史</p>&l

19、t;p>　　1.1.1 弧菌簡介及分類學(xué)現(xiàn)狀</p><p>　　弧菌分布廣泛，與人類生活密切相關(guān)[1]。傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)主要在菌落的形態(tài)特征和生理生化特征如菌體的顯微結(jié)構(gòu)形狀，弧度大小，鞭毛數(shù)量與分布，莢膜有無與莢膜的形態(tài)特征以及弧菌運動性等方面和如革蘭氏染色，發(fā)酵葡萄糖反應(yīng)，氧化酶反應(yīng)等相應(yīng)的生理生化特征來對弧菌進行分類。多年來，許多學(xué)者致力于弧菌分類學(xué)的研究，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(1984，九版)

20、[3]自問世以來，有許多過去未能認(rèn)定的致病性弧菌有所證實及歸屬，這在弧菌分類史上是一個非常重要的里程牌。在眾多的弧菌之中，不同種的致病性差異很大，而隨著當(dāng)今發(fā)現(xiàn)的弧菌種類日益增加，弧菌分類學(xué)在致病性差異上的研究日趨重要。如O1型霍亂弧菌被WHO定為國際檢疫菌，但許多與O1相似菌株卻并不具備致病性[2]。但是目前弧菌分類學(xué)系統(tǒng)仍有諸多不足，而且隨著日益增加的弧菌種類和近似菌種的細(xì)致區(qū)分以及由于菌種之間致病因子的橫向基因轉(zhuǎn)移等導(dǎo)致傳統(tǒng)的分類

21、鑒定的局限性日益明顯。</p><p>　　1.1.2 弧菌分類學(xué)歷史</p><p>　　17世紀(jì)80年代，列文虎克首次用自制顯微鏡觀察到微生物這標(biāo)志著微生物形態(tài)學(xué)發(fā)展階段的起始點。但直至19世紀(jì)60年代初，關(guān)于弧菌分類學(xué)所進行的觀察和記載，仍只停留在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)分類上[4]。19世紀(jì)60年代初，巴斯德（Louis Pasteur ）、柯赫（Robert Koch）等一大批杰出科學(xué)家建立

22、了一套獨特的微生物研究方法，成為微生物生理生化分類學(xué)的標(biāo)志[5]。在這個時期，霍亂和狂犬病等傳染病的致病病因等重大發(fā)現(xiàn)，以及固體培養(yǎng)基的改進，劃線法的純種分離，建立了細(xì)菌細(xì)胞的染色技術(shù)，顯微攝影技術(shù)和懸滴培養(yǎng)法，為弧菌的生理學(xué)分類提供了重要的生物技術(shù)基礎(chǔ)。這時的弧菌分類學(xué)主要以弧菌的生理生化特征為基礎(chǔ)而進行分類學(xué)相關(guān)研究。20世紀(jì)50年代初，隨著分子生物學(xué)的興起以及日益增加的高新技術(shù)出現(xiàn)，對弧菌的研究進入到分子生物學(xué)的水平。1977年，

23、 C. Weose等經(jīng)過分析原核生物16S rRNA基因序列和真核生物18S rRNA基因序列后，提出了可將自然界生物分為細(xì)菌、古菌和真核生物三域，揭示了各生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[6,7]，這標(biāo)志著弧菌分類進入到分子水平階段。</p><p>　　16S rRNA簡介與應(yīng)用</p><p>　　16S rRNA基因有11個恒定區(qū)(constant region) 和10個可變區(qū)(varia

24、ble region)，恒定區(qū)相對保守，而可變區(qū)因細(xì)菌而異，其變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)[8]。</p><p>　　16S rRNA基因由大約1 550個核苷酸組成，其長度既能夠表現(xiàn)足夠的種間多態(tài)性，又便于序列分析。大量研究試驗證明，總體來說，16S rRNA基因比較適合用于揭示各種生物物種間的種屬親緣程度。歷時久遠(yuǎn)的演化歷程中，16S rRNA基因進化速率非常緩慢，因此16S rRNA基因適合用于作為生

25、物進化距離及其種屬親緣程度的分子標(biāo)記。目前想獲得16S rRNA基因的精確突變速率仍還有很多問題尚待解決，相異的種群進化速率不同，相同的種群進化速率也不一定相同，且其基因中含有高速率突變的 “熱點”區(qū)以及高度保守區(qū) [9]。但鑒于16S rRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和進化距離相對應(yīng)，既含保守又有可變序列等，因此已是細(xì)菌分類學(xué)中最常用、最有用的分子鑒定基因。通過分析16S rRNA基因序列，可以判定不同菌

26、屬、菌種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近，如DNA雜交同源性在60％一70％以上，或細(xì)菌間16S rRNA序列同源性達97％以上的菌株就可定為一個種，如同源性只有95％，則判定為屬于不同屬[10]。16S rRNA基因序列分析檢測的優(yōu)勢是速度快，高通量，高精確性等，常規(guī)的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)</p><p>　　1.3 研究的意義與內(nèi)容</p><p>　　雖然有些弧菌致病力之間差異較大，但基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)檢測和生理

27、生化指標(biāo)較難區(qū)分這些弧菌，這給臨床上的應(yīng)用和水產(chǎn)品養(yǎng)殖病害的預(yù)防和診治帶來了諸多不便。通過應(yīng)用16S rRNA基因可以快速鑒定在表型上難以區(qū)分的弧菌。哈氏弧菌與創(chuàng)傷弧菌之間，以及雙氮弧菌與鰻弧菌等通過表型難以區(qū)分，通過16S rRNA基因來對弧菌進行鑒定和區(qū)別已經(jīng)有學(xué)者對此作出研究[12-14]。</p><p>　　本研究主要通過弧菌群落特征對所分離純化得到的弧菌進行初步鑒定，然后通過弧菌總DNA的提取及16S

28、 rRNA基因的擴增獲取，經(jīng)測序后運用生物信息學(xué)的相關(guān)知識利用相關(guān)軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建從而確定這兩株未知弧菌的分類學(xué)地位。另本研究針對傳統(tǒng)法提取弧菌總DNA的不足做出改進，擬得出最佳改良弧菌總DNA提取方法。</p><p>　　本研究目標(biāo)是獲取最佳改良弧菌總DNA提取方法，以及通過16S rRNA基因獲取及分析，對環(huán)境樣品中所采取的兩株未知菌進行分子鑒定從而確定這兩株弧菌的種屬等分類學(xué)地位。</p&g

29、t;<p>　　本研究基于弧菌16S rRNA基因特性，應(yīng)用PCR技術(shù)研究環(huán)境樣品中兩株優(yōu)勢弧菌的種屬地位，旨在為大規(guī)模研究菌落生態(tài)演替和生長環(huán)境變化打下理論和工具基礎(chǔ)，同時為水產(chǎn)品養(yǎng)殖病害的預(yù)防和診治提供理論支持和技術(shù)支撐。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 實驗材料、儀器和試劑</p>&

30、lt;p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　本實驗選用的環(huán)境樣品為于2009年8月采集的朱家尖淺水區(qū)水樣。通過利用TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，梯度稀釋平板法分離純化出相應(yīng)的兩株菌。已分離的菌株斜面在4℃冰箱中保存，以備使用。實驗前對相應(yīng)菌株用LB液體培養(yǎng)基進行擴繁培養(yǎng)12h左右。</p><p>　　2.1.2 儀器與設(shè)備</p>

31、<p>　　1. BIO—RAD梯度PCR儀 （PTC0100） 江蘇省科學(xué)器材有限公司</p><p>　　2. Eppendorf 微量移液器 上海艾研生物科技有限公司</p><p>　　3. Eppendorf centrifuge 冷凍離心機

32、（5415R） 上?？蠌娰Q(mào)易有限公司</p><p>　　4. Eppendorf centrifuge 冷凍離心機（5415D） 上海齊羿電子科技有限公司</p><p>　　5. 電泳儀（BG—Power600i） 上海精宏實驗設(shè)備有限

33、公司</p><p>　　6. 電子天平（AL104） 梅特勒—托利多儀器有限公司</p><p>　　7. 臺式高速冷凍離心機（TGL—16M） 長沙湘儀離心機儀器有限公司</p><p>　　8. REVCD 1386-3V型超低溫冰箱

34、 美國REVCD公司</p><p>　　9. Galanz微波爐（PTO23TP—KT） 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司</p><p>　　10. 電熱恒溫水槽(DK—8D型) 上海精宏實驗設(shè)備有限公司

35、 </p><p>　　11. 紫外可見分析裝置 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　12. RXZ智能型人工氣候箱 寧波江南儀器廠</p><p>　　13. 手掌型離

36、心機（LX—100） 寧波江南儀器廠</p><p>　　14. XYJ—875凈化工作臺（GB6168—85） 蘇州市偉業(yè)空調(diào)凈化有限公司</p><p>　　15. 微電腦智能化控制新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG—9123A） 寧波江南儀器

37、廠</p><p>　　16. 各種規(guī)格Tips 、Tubes和培養(yǎng)皿等。</p><p><b>　　2.1.3 試劑</b></p><p>　　1. Taq DNA聚合酶(5 units.μL-1)：購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p>　　2. dNTPs 其中dATP、dGTP、dCTP、dT

38、TP均為10 mmol.L-1，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p>　　3. 10×PCR Buffer 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p>　　4. LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g.L-1，酵母提取物5 g.L-1，NaCl 10 g.L-1，PH7.0, 高溫高壓滅菌后4℃保存；</p><p>　　5. TC

39、BS培養(yǎng)基平板 TCBS按照說明書上參量調(diào)整PH7.0后加入相應(yīng)的瓊脂粉，高溫高壓滅菌后冷至60℃鋪平板； </p><p>　　6. 酚/氯仿/異戊醇 （25:24:1）(體積比) 4℃避光短期保存；</p><p>　　7. 氯仿/異戊醇 （24:1） （體積比） 4℃保存；</p><p>　　8. NaAC 5mol/l 高溫高壓滅菌后4℃保存；<

40、;/p><p>　　9. 10%SDS：SDS 10%，pH 7.2，室溫保存；</p><p>　　10. 10×TE Buffer 10mmol/L Tris-HCl，1.00 mmol/L EDTA，pH視需要而定，高溫高壓滅菌后4℃保存；</p><p>　　11. 50×TAE Buffer 配制方法：稱量Tris 242g，Na2EDTA

41、.2H2O 37.2g 于1L燒杯中； 向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆?；加?7.1ml的冰乙酸，充分溶解；加去離子水定容至1L后，室溫保存。其他倍數(shù)TAE按照對應(yīng)倍數(shù)要求稀釋即可。</p><p>　　12. CTAB/NaCl溶液：10% CTAB，0.7M NaCl 在80ml雙蒸水中溶解4.1g NaCl，然后緩慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，同時加熱并攪拌，可加熱至6

42、5℃溶解，定容終體積至100ml；</p><p>　　13. Rnase A 溶液：將Rnase A溶于10mol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，15mmol/L Nacl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，冷卻后用1.5mL離心管分裝成小份保存于-20℃。</p><p>　　2.2 方法與步驟</p><p>　　2.2.1 實驗材

43、料準(zhǔn)備及形態(tài)學(xué)觀察</p><p>　　配置TCBS培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒在平板內(nèi)，將所取得到的水樣按原液加入生理鹽水而分為五個稀釋梯度濃度接種至平板上，每個梯度做三個重復(fù)，用劃線法接種在平板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后，挑出單菌落后接種在新的TCBS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。從而分離純化得到的兩株菌。</p><p>　　兩株菌在TCBS培養(yǎng)基和2216E平板培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)1天。分別對此兩株菌

44、在TCBS培養(yǎng)基及2216E平板培養(yǎng)基生長的菌落形態(tài)學(xué)特征進行觀察記錄。</p><p>　　2.2.2 改良弧菌DNA提取方法</p><p>　　由于弧菌本身富含黏性多糖，蛋白等雜質(zhì)尤其是多糖物質(zhì)難以除去，應(yīng)用傳統(tǒng)法提取弧菌DNA效果不理想，經(jīng)過多次嘗試后用改良后的DNA提取方法DNA質(zhì)量效果較好?，F(xiàn)將改良弧菌DNA提取方法的展示步驟如下：</p><p>　　

45、1. 從培養(yǎng)皿或斜面上挑取單菌落至大試管LB液體培養(yǎng)基，大試管液體擴繁12h左右，收集10ml培養(yǎng)液，10,000 g離心2min離心；</p><p>　　2. 加入2ml TE懸浮沉淀菌體，再加入溶菌酶100 ul（50mg/ml）、Rnase A 10ul(10mg/ml)，搖勻后；37℃ 水浴30min；</p><p>　　3. 加入120ul 10%SDS和蛋白酶K(20mg/

46、ml) 10ul，混勻后；60℃ 水浴30min—1h；注意觀察粘稠度增加和破壁效果。</p><p>　　4. 加入500ul 5mol/LNaCl，320ul CTAB/NaCl，65℃ 水浴10min；</p><p>　　5. 3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混勻）；在4℃，12，000g離心10min；</p><p>　　6. 轉(zhuǎn)移上清

47、后用等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提2-3次（轉(zhuǎn)移上清過程中應(yīng)避免吸入中間沉淀雜質(zhì)，建議用剪掉尖端的Tips來吸取轉(zhuǎn)移上清）；在4℃，12，000g離心10min；</p><p>　　7. 加入1/10體積的(3mol/L)NaAC，0.6體積異丙醇（或1體積的無水乙醇）沉淀DNA；在4，12，000g離心1min；</p><p>　　8. 用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不

48、用弄起DNA沉淀，第二次洗滌弄起DNA沉淀，混勻充分后洗滌。第三次重新洗滌，盡量減少DNA里面的鹽分和其他雜質(zhì)。</p><p>　　9. 所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混勻。加入0.6倍體積的異丙醇沉淀后重新70%酒精洗滌。風(fēng)干后，用25ul水溶解樣品。</p><p>　　10. 風(fēng)干后，用50ul水溶解樣品，-20℃保藏以備進一步使用

49、。</p><p>　　2.2.3 DNA測定</p><p>　　凝膠電泳：制備1％的瓊脂糖凝膠，5μlDNA樣品和1μl 6X loading buffer混勻后添加至加樣孔，電泳100V，20min。電泳檢測可鑒定DNA樣品的完整性和質(zhì)量，通過電泳中DNA marker 也可推算出DNA大致濃度。</p><p>　　超微量紫外可見分光光度：取1μlDNA樣品

50、，以1μl ddH2O為對照，超微量紫外可見分光光度計測定OD260/OD280和濃度。</p><p>　　2.2.4 16S rRNA基因的擴增與測序</p><p>　　PCR擴增兩株未知優(yōu)勢弧菌的16S rRNA基因所用的引物為通用引物。 上游引物：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT– 3’。25μ

51、l的反應(yīng)總體系中包括：</p><p>　　模板DNA 1μL</p><p>　　PCR buffer 2μL</p><p>　　上游引物 1μL</p><p>　　下游引

52、物 1μL</p><p>　　dNTPs 2μL</p><p>　　Taqase 0.5μL</p><p>　　QQH2O 17

53、.5μL</p><p>　　總體積 25μL</p><p>　　混勻后，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3min→34個擴增循環(huán)(94℃變性45sec→溫度梯度退火→72℃延伸適當(dāng)時間→72℃繼續(xù)延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖/1×TAE凝膠電泳和紫外檢測后，回收目的DNA條帶。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測后送上海生物工程

54、技術(shù)公司測序。</p><p>　　2.2.5 生物信息學(xué)分析</p><p>　　對兩株優(yōu)勢弧菌測序后的16S rRNA 基因序列結(jié)果的生物信息學(xué)分析主要基于16S rRNA基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建來對此兩株優(yōu)勢弧菌的種屬分類學(xué)地位進行鑒定。</p><p>　　為確定測序所得的兩株未知弧菌的16S rRNA基因序列和模式弧菌的16S rRNA序列之間的相似

55、性或同源性，利用Clustal軟件將序列按照特定規(guī)律排列，利用Clustal程序序列排列在一起后進行同源性分析。Clustal程序有許多版本，ClustalW（Thompson等，1994）[15]，根據(jù)對親緣關(guān)系較近的序列間空位情況，確定如何在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的序列之間插入空位。</p><p>　　為進一步確定此兩株未知弧菌的種屬關(guān)系，我們根據(jù)基因測序結(jié)果和相關(guān)網(wǎng)站上的弧菌屬內(nèi)和弧菌屬間的16S rRNA基因序列

56、來進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建?；【鷮匍g選擇了殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)，弧菌屬內(nèi)種選擇了多株哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、多株溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）以及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）等。</p><p>　　對于此兩株未知分離菌的16S r

57、RNA基因序列通過NCBI的Blast 檢索系(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast／) 或RDP網(wǎng)站（http://rdp.cme.msu.edu/）進行序列同源性分析，并使用MEGA4.0軟件的Alignment Clustal/Align by clustal W在與GeneBank數(shù)據(jù)庫或RDP數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進行多序列匹配排列(Multiple Alignments )和成

58、對序列匹配排列（Pairwise Alignments） ，采用MEGA4.0 ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA) 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接法( neighbor joining method ) 建樹方法，并通過 Bootstrap法( 1000次重復(fù))檢驗。系統(tǒng)學(xué)分類描述不同生物之間的相關(guān)關(guān)系，通過系統(tǒng)學(xué)分類分析可幫助人們了解所有生物的進化歷史過程[16]。構(gòu)建系統(tǒng)

59、樹具體步驟如下：</p><p>　　1. 建立txt文檔，從NCBI或RDP網(wǎng)站下載不同屬種的16S rRNA基因fasta文件，將所需序列復(fù)制到記事本中。Wps建樹時，先將屬內(nèi)所有種的序列下載，還有科內(nèi)其他屬各選擇一個或多個序列下載下來，其中sp等的種不需要加入到記事本中來。</p><p>　　2.將下載的序列和已經(jīng)得到的兩株未知菌的序列并入到同一個txt文檔中，并在MEGA4.0上

60、進行比對修飾構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。</p><p>　?、?打開MEGA4.0軟件</p><p>　　②輸入序列 Alignment→Alignment Explorer/Clustal→ok→yes→復(fù)制記事本上所有序列到MEGA4.0中→Alignment Clustal/Align by clustal W→ok</p><p>　?、坜D(zhuǎn)換成MEGA格式：Da

61、ta→Export Alignment→導(dǎo)出MEGA Format和Fasta Format（命名保存）</p><p>　　④打開MEGA Format序列框→phylogeny→Boot strap Test of phylogeny→Neighbor→Joining→compute</p><p>　?、軮mage→save as Enhanced Metafile→命名保存<

62、/p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 兩株弧菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察</p><p>　　最初環(huán)境樣品為朱家尖淺水區(qū)水樣，用梯度濃度平板法在TCBS上培養(yǎng)，分離物間的菌落特征有一定差異。因此選擇來自不同編號分別為XHS-2和 461 的兩個菌株作進一步研究。</p><p>　　XHS2

63、-9號菌株和461號菌株這兩株弧菌的個體形態(tài)特征較為相似：這兩株菌革蘭氏染色均為陰性,呈短桿狀或短弧狀,都可運動, 兩株弧菌的大小均為0.6 µm-0.8 µm×0.9 µm-2 µm。而菌落形態(tài)比較見表1。</p><p><b>　　表1 菌落形態(tài)比較</b></p><p>　　table1 the comp

64、arison of the colony morphology</p><p>　　圖1A 圖1B</p><p>　　圖1 菌落形態(tài)圖（TCBS培養(yǎng)基）</p><p>　　Figure1 the figure of colonial morphology(TCBS culture medium)</p><p>　　圖

65、1A中為461號菌株，圖1B為XHS2-9號菌株</p><p>　　the figure1A represents the colonial morphology of 461 strain Vibrio，and the the figure1B represents the colonial morphology of XHS2-9 strain Vibrio</p><p>　　3.

66、2 兩株弧菌的DNA提取及測定</p><p>　　提取弧菌的總DNA 經(jīng)超微量紫外分光檢測純度（OD260/280值1.8左右）和濃度（1000ng/uL左右)均較好。利用改良法提取DNA電泳結(jié)果表明總DNA質(zhì)量較佳（見圖1中XHS-2和461），而傳統(tǒng)法提取總DNA電泳結(jié)果表明總DNA仍由于富含粘性多糖未被除去而呈滯狀（見圖2中XHS-2和461）。</p><p>　　XHS2-9

67、(2) 461(2) XHS2-9 461 M</p><p>　　圖2 兩株弧菌總DNA電泳圖</p><p>　　Figure2 The DNA gel electrophoresis of the two strains Vibrio</p><p>　　M表示為Marker，XHS2-9（2）表示為改良法提取XHS

68、2-9弧菌DNA的電泳圖，461（2）表示為改良法提取461弧菌DNA的電泳圖，XHS2-9表示為傳統(tǒng)法提取XHS2-9號弧菌DNA的電泳圖，461表示為傳統(tǒng)法提取461號弧菌DNA的電泳圖。</p><p>　　The M represents the Marker , XHS2-9(2) represents the DNA gel electrophoresis by the modefied method

69、 of the XHS2-9 strain Vibrio. 461(2)represents the DNA gel electrophoresis by the modefied method of the 461 strain Vibrio. XHS2-9 represents the DNA gel electrophoresis by the traditional method of the XHS2-9 strain Vib

70、rio. 461represents the DNA gel electrophoresis by the traditional method of the 461 strain Vibrio.</p><p>　　3.3 16S rRNA基因序列的PCR擴增與測序</p><p>　　本實驗對兩株弧菌的16S rRNA基因PCR擴增的引物為通用引物。上游引物：5’-AGAGTTTGA

71、TC(C／A)TGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT– 3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定圖如下，基因長度約1000bp左右，說明擴增目的基因成功。PCR擴增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)公司進行基因序列測定。</p><p>　　XHS2-9 461 M</p><p>　　圖3 PCR結(jié)果電泳圖</p><p>　　Fi

72、gure3 The gel electrophoresis of the PCR product</p><p>　　M表示為Marker，XHS2-9表示為以改良法提取的XHS2-9號菌株總DNA為模板，以通用引物為引物擴增出的16S rRNA基因片段，而461表示為以改良法提取的461號菌株總DNA為模板，以通用引物為引物擴增出的16S rRNA基因片段。</p><p>　　M re

73、presents the Marker. XHS2-9 represents that this 16S rRNA gene fragment is amplified with the template of the XHS2-9 strain Vibrio total DNA by the improved DNA extraction method and with the universal primer as the prim

74、er. while 461 represents that this 16S rRNA gene fragment is amplified with the template of the 461 strain Vibrio total DNA by the improved DNA extraction method and with the universal primer as the primer.</p>&l

75、t;p>　　3.4 16S rRNA基因序列分析</p><p>　　分離菌XHS2-9號菌所擴增的16S rRNA基因序列長度為1067bp，而461號菌所擴增的16S rRNA基因序列長度為1242bp。XHS2-9和461號菌株與S000426482 Vibrio harveyi (T); NCIMB1280T; AY750575菌株以及>gi|AY373027.1| Vibrio algin

76、olyticus 16S ribosomal RNA gene序列部分比對結(jié)果如下：</p><p>　　圖4 16S rRNA 基因序列部分比較分析圖</p><p>　　Figure4 the partial comparison analysis photograms of the 16S rRNA gene</p><p>　　3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析<

77、/p><p>　　16S rRNA基因序列分析鑒定一般能夠精確到種的水平，因此可以用來鑒定用其他方法難于區(qū)分的弧菌?；【鷮匍g的代表選擇了殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)模式菌（type strain），弧菌屬內(nèi)種選擇了多株哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、多株溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）以及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、擬態(tài)弧菌（Vibrio

78、mimicus）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）等參與進化樹的構(gòu)建。</p><p>　　圖5 461及XHS2-9弧菌16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹</p><p>　　Figure 5 the Phylogenetic tree of the 16S rRNA gene including 461 and XHS2-9 strain vibrios</p>

79、<p>　　分支旁的數(shù)字為Bootstrap Test 1000 次的置信度(%); 標(biāo)尺表示1%的核苷酸序列差異</p><p>　　Numbers near the branches are bootstrap probability values (%) with 1000 replicates; Scale bar corresponds to 1% difference in nucle

80、otide sequence</p><p>　　由圖5可以看出461號菌株與溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）在進化系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集為一個分支，而XHS2-9號菌株則與哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）聚集為一個分支。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1 形態(tài)學(xué)觀察</p

81、><p>　　弧菌與人類腸道感染性疾病和水產(chǎn)品養(yǎng)殖感染性疾病有關(guān)，與人類生活密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)研究表明，已知的致病弧菌有70多種，哈維氏弧菌(V．harvey)、副溶血弧菌(V．parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V．a(chǎn)lginolyticus)、鯊魚弧菌(V．carchariae) 、 霍亂弧菌（V.cholerae）、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、鰻弧菌(V．a(chǎn)nguillarum)和最

82、小弧菌(V．mimicus)等是主要的致病弧菌。其中溶藻弧菌與哈維氏弧菌較難區(qū)分，因為溶藻弧菌與哈維氏弧菌都同屬于哈維氏弧菌群，在系統(tǒng)分類學(xué)上，通過形態(tài)學(xué)觀察以及生理生化檢測都難以達到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。分離的兩株弧菌菌落形態(tài)上有一定的相似性，光學(xué)顯微鏡下觀察到的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可運動性，大小也很相似。菌落形態(tài)之間有一定差異，溶藻弧菌的菌落（TCBS培養(yǎng)基）直徑一般稍大于哈維氏弧菌。菌落濕度，色澤，邊緣規(guī)則性也有所不同。但是根據(jù)以上的結(jié)果，僅通過

83、形態(tài)學(xué)觀察只能給出初步的判斷而不能做出最終鑒定結(jié)果的依據(jù)。本次實驗并未涉及相關(guān)的生理生化鑒定反應(yīng)，根據(jù)相關(guān)資料，弧菌屬菌種具有兼性厭氧、氧化酶陽性、發(fā)酵葡</p><p>　　4.2 改良弧菌DNA提取方法</p><p>　　傳統(tǒng)法提取的DNA對于弧菌來說，由于特性各異，有些較為適用，但是仍有大量弧菌由于富含黏性多糖、RNA等雜質(zhì)而導(dǎo)致提取DNA效果不佳。通過試劑盒（MOBio Ult

84、raclean soil DNA isolation kit）提取的弧菌總DNA效果也較好，但是若提取弧菌DNA的種類繁多時，費用較多。而使用改良法提取DNA利用CTAB/NaCl和高鹽條件下黏性多糖沉淀的特點而除去多糖，對提取后的DNA重新使用NaCl提高DNA溶液中鹽濃度而重新洗滌而進一步除去黏性多糖，這樣提取的DNA效果較為理想，也適合進一步的實驗以及保藏備用。</p><p>　　4.3 弧菌分子鑒定結(jié)

85、果</p><p>　　16S rRNA基因的功能同源性高而且古老，其中既含有保守序列又含可變序列，分子大小適合操作，且其序列變化與進化距離相適應(yīng)，因此16S rRNA基因是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的“分子鐘”。通過分析16S rRNA基因序列，可以判定不同菌屬、菌種間遺傳關(guān)系及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，如：DNA雜交同源性在60％一70％以上，或細(xì)菌間16S rRNA序列同源性達到97％以上的菌株就可定為一個種，如

86、同源性只有95％，則判定為屬于不同屬[17]。應(yīng)用16S rRNA基因可以快速鑒定表型上難以區(qū)分的弧菌。哈氏弧菌與創(chuàng)傷弧菌之間，以及雙氮弧菌與鰻弧菌等通過表型難以區(qū)分，通過16S rRNA基因來對弧菌進行鑒定和區(qū)別已經(jīng)有學(xué)者對此作出研究。但對于哈維氏菌群內(nèi)通過16S rRNA基因來鑒定尚未有人做出鑒定，而且16S rRNA基因分析的高速度，高精度，高通量可以為大規(guī)模研究菌落生態(tài)演替和生長環(huán)境變化打下理論和工具基礎(chǔ)。

87、 </p><p>　　Blast分析結(jié)果表明XHS2-9號菌株的16S rRNA基因序列與包括模式菌株在內(nèi)的幾株哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）最為接近,相似性均為 98%以上, 而與所有其它弧菌相似性均不到 93%。461菌株的16S rRNA基因序列與包括模式菌株在內(nèi)的幾株溶藻弧菌（Vibrio harveyi）最為接近,相似性均為98%以上,而與所有其它弧菌相似性均不到 93%。4

88、61號菌株、XHS2-9號菌株與溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌模式菌株的16S rRNA基因序列比較如圖4。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖 5) 上 461號菌株與溶藻弧菌緊密聚集為一個分支, 而與其它弧菌明顯區(qū)分。XHS2-9號菌株與哈維氏弧菌緊密聚集為一個分支，而與其他弧菌明顯區(qū)分，綜合上述形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析結(jié)果, 可將菌株461鑒定為溶藻弧菌，XHS2-9號菌株為哈維氏菌株。</p&

89、gt;<p><b>　　5 結(jié)論</b></p><p>　　1.本文建立了一種基于CTAB-NaCl法的改良的DNA提取的方法，主要通過對黏性多糖的沉淀而多步除去，從而從富含黏性多糖的弧菌中提取獲得了高質(zhì)量的DNA。</p><p>　　2.本文以16S rRNA基因作為分子標(biāo)記對環(huán)境樣品中分離的兩株未知弧菌樣品進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析從而對其分類學(xué)地位進

90、行鑒定，鑒定結(jié)果為461號菌株為溶藻弧菌，而XHS2-9號菌株為哈維氏弧菌。</p><p>　　3.利用16S rRNA基因作為鑒定這兩種較難區(qū)分的在海水特別是近岸養(yǎng)殖海水中較常見的優(yōu)勢弧菌，將會為水產(chǎn)品養(yǎng)殖、環(huán)境微生物學(xué)中群落更替以及校正過去系統(tǒng)分類學(xué)的錯誤提供一種重要的工具手段。雖然16S rRNA基因序列具體分子進化的系統(tǒng)發(fā)育機理目前還未能有明確的結(jié)論，但是本次實驗作為弧菌系統(tǒng)分子分類學(xué)的一部分，一方面有

91、助于進一步闡明弧菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，另一方面也為通過進一步研究與其他相關(guān)基因結(jié)合更進一步提高分子鑒定的分辨率從而為弧菌系統(tǒng)分類學(xué)提供了更多的實驗支持，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[ M]. 北京科學(xué)出版社. 2001: 106-128.</p&g

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106、HS2-9號菌株的16S rRNA基因測序結(jié)果：</p><p><b>　　>XHS2-9 </b></p><p>　　GGAGGTTGCGTAGCCTGATACGTGCAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGG

107、GGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT