一株弧菌拮抗菌的鑒定、抑菌特性及應用效果的初步研究.pdf

1、近年來，伴隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，各種養(yǎng)殖生物受到的病害威脅也越來越嚴重。病害的發(fā)生不僅帶來巨大的經濟損失，也給環(huán)境帶來較大的影響。而為防治水產生物病害而濫用抗生素等化學藥物，則會對環(huán)境和人類產生嚴重的影響。益生菌作為抗生素的替代品，可以抑制病原菌，為養(yǎng)殖動物提供營養(yǎng)，提高養(yǎng)殖動物的免疫力，改善水質條件，修復微生態(tài)環(huán)境，因此益生菌的在水產養(yǎng)殖中使用日漸受到人們的重視。益生菌的作用機理之一是通過產生抑菌物質來抑制病原菌的生長。因此，選擇

2、具有較高抑菌活性的細菌作為潛在的益生菌進行研究開發(fā)具有重要的實踐意義。
　　本研究對從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離出一株對弧菌病原菌具有拮抗作用的菌株進行了鑒定、產物性質分析和應用的初步研究，旨在為將其最終應用于對蝦養(yǎng)殖實踐提供理論基礎。研究獲得的具體結果如下:
　　1.一株弧菌拮抗菌的分類鑒定及其抑菌作用研究
　　本研究從對蝦養(yǎng)殖池塘分離篩選出一株對病原菌有拮抗作用的菌株，編號為BL1。采用十字交叉法、點種法以及牛津杯法對其進

3、行了體外拮抗試驗，以確定其抑菌譜。研究結果顯示，菌株BL1對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticu)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)及副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)具有明顯拮抗作用。根據(jù)細菌形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。采用單因素分析法進一步研究了菌株BL1的最佳培養(yǎng)條件，確定其在培養(yǎng)溫度28℃、初始pH7.0、接種量

4、1％(V/V)、轉速190rpm/min的條件下生長狀況最好。
　　2.菌株BL1抑菌產物的初步分離與性質分析
　　本研究以優(yōu)化培養(yǎng)條件后的枯草芽孢桿菌BL1（Bacillus subtilis）發(fā)酵液為研究對象，以刨傷弧菌(Vibrio vulnificus)為指示菌，采用牛津杯法作為檢測方法，對菌株BL1發(fā)酵液中起抑菌作用的抑菌活性物質的性質進行了初步研究。培養(yǎng)時間對抑菌效果影響的實驗顯示，培養(yǎng)24h后的菌液抑菌活性最好

5、;采用過濾、飽和硫酸銨沉淀及超濾等方法對培養(yǎng)24h的菌株BL1的發(fā)酵液進行初步分離純化處理，結果顯示枯草芽孢桿菌BL1發(fā)酵液中的抑菌物質為胞外分泌型、非蛋白類、分子量大于10kDa的物質;對經過初步分離純化的抑菌物質進行穩(wěn)定性的研究，發(fā)現(xiàn)抑菌物質對高溫（60-100℃）和pH（3.0-11.0）的耐受能力比較強，對蛋白酶K不敏感?？梢钥闯觯闎L1所產生的抑菌物質具有很好的抑菌作用及穩(wěn)定性，表明該菌株可能具有作為益生菌應用于海水養(yǎng)殖的

6、潛力。
　　3.潑灑和投喂拮抗菌BL1對凡納濱對蝦生長和水體弧菌數(shù)量的影響
　　本研究對潛在益生菌BL1進行了菌株安全性檢驗后，以潑灑和投喂兩種方式將菌株BL1應用于凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖中，以期了解其對凡納濱對蝦生長及水體中弧菌數(shù)量的影響。兩種方式均設置3個不同的濃度梯度，其中，投喂組添加量分別為107、109和1011cfu/kg（以活菌量計），潑灑組添加量分別為106、108和101

7、0cfu/m3，以投喂基礎飼料組為對照組，潑灑周期為5天，實驗共持續(xù)42天。實驗過程中任選1個潑灑周期按潑灑后12h以及1、2、3、4和5d定時采樣測定水體弧菌數(shù)量。實驗結束時測量對蝦的生長情況，餌料利用率及存活率。實驗結果顯示:(1)生長方面，在兩種施用方式下，除了潑灑組106 cfu/m3，其他處理組中菌株BL1均能顯著促進對蝦生長，提高對蝦的特定生長率(SGR)和餌料利用率(FER)。其中，投喂組以109cfu/ m3為最適濃度，