一株抗菌海洋放線菌的分離鑒定及其活性成分的初步研究.pdf

1、本研究以遼寧、山東、浙江、福建、廣西等地采集的海泥樣品中分離、純化獲得的放線菌為供試菌，嗜水氣單胞菌C4eromonas hydrophila，編號(hào)ST78-3-3)、腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas punctata f．instestinalis，編號(hào)XP91-4-1)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum，編號(hào)E-3-11)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonida)、哈維弧菌(Vibrioharvey)、

2、大腸桿菌(Eschenchia coli)和金黃葡萄球菌(Staphlococcus aureus)為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法和平板孔阱擴(kuò)散法，篩選出一株具有抗菌譜廣、活性較強(qiáng)的放線菌FA-F-5。通過多相分類法鑒定、水產(chǎn)動(dòng)物疾病治療試驗(yàn)、對(duì)鯽魚免疫功能的影響試驗(yàn)、FA-F-5發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)、抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)以及對(duì)抗菌活性物質(zhì)的初步分離進(jìn)行了研究，得到如下結(jié)論： 1、FA-F-5的分離鑒定：通過對(duì)FA-F-5的16S rD

3、NA序列測定，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，其同弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的相似率達(dá)到98.5％；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明二者之間的進(jìn)化距離相隔較近；結(jié)合放線菌FA-F-5的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性，將其確定為弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。 2、FA-F-5發(fā)酵液生物治療試驗(yàn)：以嗜水氣單胞菌感染健康鯽魚，投喂含有抗菌活性物質(zhì)的藥餌，當(dāng)飼料中抗菌物質(zhì)

4、用量達(dá)到370 μg/kg．d時(shí)，鯽魚沒有發(fā)病，解剖內(nèi)臟器官劃平板無嗜水氣單胞菌，證明該活性物質(zhì)在生物體內(nèi)具有較好的抗菌效果；分別以最佳治愈劑量的5倍量和10倍量飼喂鯽魚，其內(nèi)臟和體表未表現(xiàn)任何毒理現(xiàn)象，說明該活性物質(zhì)對(duì)鯽魚無急性毒性。 3、FA-F-5發(fā)酵液對(duì)鯽魚免疫功能影響試驗(yàn)： FA-F-5發(fā)酵液經(jīng)濃縮制餌投喂鯽魚，連續(xù)投喂14d，分別于0d,7d,14d檢測鯽魚吞噬細(xì)胞殺菌活性和血清凝集抗體效價(jià)，以研究該抗菌活性成分對(duì)鯽

5、魚免疫功能的影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)組吞噬細(xì)胞殺菌活性和血清凝集抗體效價(jià)與對(duì)照組相比存在顯著性差異(P<0.01)，證明該抗菌活性成分能增強(qiáng)鯽魚的免疫功能。 4、FA-F-5發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)：應(yīng)用正交試驗(yàn)對(duì)海洋放線菌FA-F-5的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳培養(yǎng)基配方為：麥芽糖15g/L、黃豆粉25 g/L、CaCO3 1 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO47H2O 0.5 g/L、海鹽10 g/L，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵培

6、養(yǎng)基初始pH 7、發(fā)酵溫度為25℃、種子液菌齡為48 h、接種量為125mL/L、裝樣量為100 mL/L、發(fā)酵時(shí)間為96h。最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵液抗菌活性相對(duì)于慶大霉素和環(huán)丙沙星的效價(jià)分別為為2815IU/mL和61.43 mg/L。 5、FA-F-5抗菌活性成分穩(wěn)定試驗(yàn)：分別對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行不同溫度、pH、光照強(qiáng)度、儲(chǔ)存時(shí)間等處理，測定處理前后發(fā)酵液的抗菌活性的變化。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在處理前后發(fā)酵液中的抗菌活性成分的抑菌圈直徑未發(fā)生變

7、化，說明其具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，光穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。 6、抗菌活性物質(zhì)的初步分離純化：FA-F-5發(fā)酵液經(jīng)離心濃縮、732型樹脂吸附、聚酰胺柱層析、醇沉，獲得抗生素粗品。經(jīng)碘化鉍鉀薄層顯色試驗(yàn)證明該抗生素粗品屬于氨基環(huán)醇類抗生素。 本試驗(yàn)獲得的具有抗菌活性的放線菌，對(duì)于微生物資源的開發(fā)利用具有重要意義。同時(shí)對(duì)海洋放線菌FA-F-5分類地位、發(fā)酵液生物有效性、發(fā)酵條件優(yōu)化及活性物質(zhì)的初步分離純化進(jìn)行了初步研究，