太湖溶藻菌強(qiáng)化除藻作用與機(jī)制的研究.pdf

1、課題組從位于太湖梅梁灣水域的試驗(yàn)基地分離篩選出具有顯著生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用的4株不同種屬的高效土著溶藻菌。在進(jìn)行溶藻菌的微生物學(xué)種屬鑒定、生物除藻作用、現(xiàn)場(chǎng)中試研究的基礎(chǔ)上，著重探討了溶藻菌除藻作用的機(jī)制：借助課題組新合成的納米人工載體，采用微生物固定化技術(shù)，探討了固定化溶藻菌的強(qiáng)化除藻作用，以期發(fā)展一種新型的生物除藻技術(shù)，應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化水體除藻工程中；同時(shí)以模式生物秀麗線蟲(chóng)作為試驗(yàn)對(duì)象，研究了在低作用劑量下，MC-LR對(duì)線蟲(chóng)

2、的壽命、行為、生長(zhǎng)發(fā)育和生殖機(jī)能等毒性作用和神經(jīng)毒作用機(jī)制，以及MC－LR溶藻菌生物降解產(chǎn)物的毒性作用。 一、高效太湖溶藻菌的鑒定和除藻作用評(píng)價(jià) 自太湖試驗(yàn)基地除藻中試裝置的組合介質(zhì)中，分離獲得了24h溶藻率達(dá)40％以上的土著溶藻菌20株，經(jīng)分析，其優(yōu)勢(shì)土著溶藻菌為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬。從中選取4株代表性的高效太湖土著溶藻菌，采用傳統(tǒng)細(xì)菌分類學(xué)（形態(tài)學(xué)、APIID32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)）、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技

3、術(shù)對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定。初步確定該4株溶藻菌分別為副溶血弧菌、萎縮芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、斑點(diǎn)氣單胞菌。 4株高效土著溶藻菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用的能力。在起始濃度為106/mL時(shí)，對(duì)濃度為5．57×107個(gè)/ml銅綠微囊藻作用72h后的溶藻率均達(dá)到100％，對(duì)起始濃度為12．4mg/L胞外MC-LR作用72h的降解率分別為71．8％、68．9％、73．7％和80．6％，而對(duì)胞內(nèi)MC-LR的降解率低于同期對(duì)胞外M

4、C-LR的降解率。以MC-LR濃度的對(duì)數(shù)值和作用時(shí)間的曲線進(jìn)行線性擬合分析，結(jié)果顯示該4株溶藻菌對(duì)MC-LR的降解反應(yīng)基本符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)降解反應(yīng)。對(duì)影響4株溶藻菌生物降解作用的因素進(jìn)行分析，MC-LR與溶藻菌的濃度之比、溶藻菌的生物學(xué)特性（金屬離子等）等均可影響溶藻菌對(duì)MC-LR的降解作用。 中試試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶藻菌同樣表現(xiàn)出較好的生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用。其中菌培養(yǎng)液和胞外液在作用96h后，水體中葉綠素α含量分別下降了4

5、1．8％和28．3％，MC-LR濃度分別下降了43．2％和20．5％，CODMn含量分別下降了33．6％和25．6％。 二、太湖溶藻菌除藻機(jī)制的研究 通過(guò)對(duì)斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌的不同處理組分進(jìn)行溶解銅綠微囊藻細(xì)胞和降解MC-LR作用的試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，相比于胞外活性物質(zhì)，無(wú)論是細(xì)菌菌體，還是細(xì)菌內(nèi)物質(zhì)，對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的溶解率和MC-LR的降解率都遠(yuǎn)低于胞外物質(zhì)，由此說(shuō)明，斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌主要是通過(guò)分泌胞外活性物質(zhì)的方式發(fā)揮

6、生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用的。 對(duì)經(jīng)不同條件和方式處理后的溶藻菌胞外活性成分進(jìn)行生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用試驗(yàn)，結(jié)果表明，在pH5-9的范圍內(nèi)，胞外活性成分的溶藻作用在弱酸性條件下會(huì)受到抑制，而弱堿條件有助于增強(qiáng)其溶藻作用；胞外活性成分對(duì)溫度相對(duì)穩(wěn)定，在30℃-121℃范圍內(nèi)，且隨著溫度的升高，其溶藻率也逐步增加，說(shuō)明高溫可能有助于提高活性成分的溶藻能力；經(jīng)石油醚、氯仿和乙酸乙酯等不同極性的溶劑萃取后，水相組48h的溶藻

7、率分別為72．5％、62．2％和49．1％，MC-LR降解率分別為54．4％、48．5％和36．7％，由此說(shuō)明，溶藻菌胞外物質(zhì)經(jīng)不同極性溶劑的萃取后，含量存在較大差異，隨著溶劑極性的降低（極性：石油醚<氯仿<乙酸乙酯），水相中萃取到的活性成分的含量越高，顯示出活性成分具有較強(qiáng)的親水性。同時(shí)，溶藻菌胞外活性成分在醇析沉淀物中的含量較高，在抽提液中的含量較低；對(duì)胞外濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性和定量測(cè)定，均未檢出蛋白質(zhì)的存在。由此推測(cè)，斑點(diǎn)氣單胞溶

8、藻菌分泌的具有生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用的胞外活性物質(zhì)很可能是一類具有較好的熱穩(wěn)定性、親水性的小分子物質(zhì)。 三、固定化溶藻菌的強(qiáng)化除藻作用 以課題組制備的2種新型的納米材料氧化鐵納米顆粒和聚己內(nèi)酯納米纖維膜作為載體介質(zhì)：其中Fe2O3納米顆粒采用共沉淀法制備獲得，從其表征可知，F(xiàn)e2O3納米粒子呈球形，分布均勻，平均直徑約為37nm；聚己內(nèi)酯納米纖維膜（NMP）材料，采用的納米級(jí)高分子纖維膜是由親水性聚酯納米纖維或者

9、含有添加劑的親水性聚酯納米纖維無(wú)規(guī)堆砌而成，纖維直徑為100nm-5000nm。 氧化鐵納米顆粒和聚己內(nèi)酯納米纖維膜均具有很好的固定化溶藻菌的功效：劑量為0．40mg/mL的氧化鐵納米顆粒對(duì)濃度為104個(gè)/mL，溶藻菌3h的固定化率達(dá)到38．0％，遠(yuǎn)高于普通Fe2O3（P<0．05），而且在反應(yīng)3h后就達(dá)到了飽和。通過(guò)粒徑大小及粒徑分布測(cè)定，發(fā)現(xiàn)氧化鐵納米顆粒與細(xì)菌混合后的顆粒物的平均直徑增加到氧化鐵納米顆粒的12．3倍，同時(shí)氧

10、化鐵納米顆粒和細(xì)菌單獨(dú)存在時(shí)的粒徑分布峰消失。聚己內(nèi)酯納米纖維膜30h固定化溶藻菌的濃度約為3．39×107/ml，每平方厘米固定化溶藻菌的數(shù)量約為5．65×107個(gè)，其固定化率約在30h達(dá)到高峰。 2種介質(zhì)載體固定化溶藻菌表現(xiàn)出了較好的生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用：其中氧化鐵納米顆粒固定化芽孢桿菌作用24h后，對(duì)銅綠微囊藻的溶藻率達(dá)到53．0％，MC-LR的降解率達(dá)到33．0％，分別是對(duì)照組的1．2倍和1．6倍。聚己內(nèi)酯納米

11、纖維膜固定化假單胞溶藻菌、斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌對(duì)藻細(xì)胞48h的降解率分別為85．7％和87．2％，對(duì)MC-LR48h降解率分別達(dá)到60．16％和70．94％，效果優(yōu)于市場(chǎng)上2種成熟的商品化介質(zhì)材料。聚己內(nèi)酯納米纖維膜可重復(fù)利用的次數(shù)為4次，添加葡萄糖、蛋白胨等溶藻菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，有助于提高固定化溶藻菌的生物降解藻細(xì)胞和MC-LR作用。 四、應(yīng)用秀麗線蟲(chóng)評(píng)價(jià)MC-LR及其降解產(chǎn)物的生物毒性作用 本研究探討了秀麗線蟲(chóng)（C．eleg

12、ans）在MC-LR毒性作用評(píng)價(jià)中的可行性和評(píng)價(jià)指標(biāo)的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在40-80μg/L的濃度范圍內(nèi)，MC-LR能夠縮短C．elegans的壽命、延緩發(fā)育；在10μg/L染毒劑量時(shí)，MC-LR能夠?qū)е翪．elegans的世代生殖時(shí)間和行為運(yùn)動(dòng)能力的改變；而在1μg/L染毒劑量時(shí)，線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量仍顯著下降。此外，神經(jīng)、肌肉、消化、生殖系統(tǒng)中hsp-16-2-gfp的表達(dá)率升高，表明其對(duì)MC-LR的應(yīng)激反應(yīng)率增強(qiáng)，可作為MC-LR導(dǎo)致

13、C．elegans氧化應(yīng)激作用的早期標(biāo)志。因此，C．elegans是一種可用于MC-LR毒性評(píng)價(jià)的有價(jià)值的指示動(dòng)物，C．elegans的產(chǎn)卵量和hsp-16-2-grg表達(dá)率是評(píng)價(jià)MC-LR毒性的敏感指標(biāo)，而神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)可能較早受到MC-LR的影響。 研究表明，C．elegans的神經(jīng)系統(tǒng)也是較早受到MC-LR影響的器官和系統(tǒng)之一。MC-LR可導(dǎo)致C．elegans對(duì)氯化鈉和丁二酮的化學(xué)趨向性和溫度趨向性的嚴(yán)重缺陷，這種神

14、經(jīng)毒性主要是由相應(yīng)的感覺(jué)神經(jīng)元（如ASE、AWA、和AFD）和中間神經(jīng)元AIY的功能及其分子水平的損傷所致。與野生型線蟲(chóng)N2相比，che-1（p674）、odr-7（ky4）、ttx-1（p767）、ttx-3（ks5）等多種線蟲(chóng)突變體對(duì)氯化鈉和丁二酮的化學(xué)趨向性和溫度趨向性有顯著的下降。在10μg/L染毒劑量時(shí)，C．elegans的che-1和odr-7基因的表達(dá)水平顯著下降（P<0．05），而ttK-1和ttx-3基因的表達(dá)水平在1